초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
가. 제1세부과제 : 구제역바이러스 유전정보 확보/제공 및 효능평가
1. 주변지역의 구제역 발생 상황 및 유행되는 바이러스의 분석
- O형의 경우 ME-SA 지역형에 속하는 바이러스가 우세하게 발생되고 있으며, 그 다음 SEA/Mya98, Cathay 지역형의 순이었다.
- A형은 ASIA/Sea-97 주가 최근 많이 발생되고 있으며, O ME-SA 지역형 다음으로 많이 발생하는 바이러스이다.
- 특히 A형은 국내분리주 A/Pocheon/KOR/2010을 기초로 하여 A Malay

5. 최종 연구결과 요약
가. 제1세부과제 : 구제역바이러스 유전정보 확보/제공 및 효능평가
1. 주변지역의 구제역 발생 상황 및 유행되는 바이러스의 분석
- O형의 경우 ME-SA 지역형에 속하는 바이러스가 우세하게 발생되고 있으며, 그 다음 SEA/Mya98, Cathay 지역형의 순이었다.
- A형은 ASIA/Sea-97 주가 최근 많이 발생되고 있으며, O ME-SA 지역형 다음으로 많이 발생하는 바이러스이다.
- 특히 A형은 국내분리주 A/Pocheon/KOR/2010을 기초로 하여 A Malaysia97과 가장 높은 유사성을 보였으며, 중국에서 분리된 바이러스 A/GDMM/CHA/2013와 가장 유사성이 가장 높았다.
2. 대장균 후보백신을 접종 소 혈청을 이용한 교차방어 예측 조사
- O형 및 Asia1 형은 대부분 바이러스 주에 상관없이 시제백신과 잘 매칭되는 항체수준을 보인 반면, 역시 예상했던 것과 같이 A형은 다양한 항원성상 때문에 교차중화항체가 다양하게 형성되었다
- epitope 141-160/200-213 보다는 epitope 141-160 항원 유사율은 더욱 중화항체와의 상관성은 높았다.
- 백신에 삽입되는 아미노산과의 유사성을 분석한 결과 O형은 O/Andong/SKR/2010과 A형은 A/Pocheon/SKR/2010 및 Asia1형은 Asia1/MOG/05의 바이러스와 중화시험에서 높은 반응성을 보였고, 이를 기준으로 할 경우 O, Asia1형은 여러 혈청형 바이러스에 문제없이 방어되는 것으로 판단되었으며, A형의 경우 아미노산의 변화는 그리 크지 않았으나, r-value가 서로 많은 차이를 보였다.
3. 공격접종용 바이러스의 돼지에서의 접종과 병원성 조사
- A/Pocheon/SKR/2010, A Malaysia97, A22, Asia1 Shamir, Asia1/Mog/2005바이러스에 대해 돼지에서의 공격접종을 실시하여 A Malaysia97 만이 병원성이 매우 낮았으며, 공격 모델로 A/Pocheon/SKR/2010, A22, Asia1 Shamir, Asia1/Mog/2005 바이러스들은 가능하다고 판단된다.
4. 백신의 현장적용 모델링을 통한 면역회피 평가
- E.coli-Epitope 백신이 항체 회피 변이주의 분석을 위하여 본 백신을 접종하였던 O, A, Asia1에 대한 소유래 항혈청을 중화항체의 4배 수준의 존재하에서 변이주 형성 여부를 확인
- 20대 까지 계대하여 5, 10, 15, 20대 계대하여 그 변이를 염기서열 분석을 통하여 변이 형성 여부를 확인
5. 백신의 현장적용 모델링을 통한 계대 바이러스의 주요 아미노산 분석
- O형은 Manisa에서 2개의 아미노산 변이를 갖았고, A형은 변이 형성이 없었으며, Asia1형의 경우는 1개 아미노산의 변이형성을 보였음.
- 가장 중요한 변이형성부위인 140-160, 200-213를 분석할 경우 O Manisa에서 200-213 부위에서의 변이가 형성되었고, Asia1 Shamir의 경우 140-160에서 1개의 변이가 형성됨
- 대부분의 바이러스에서 변이형성이 되지 않았기 때문에 항체저항성에 변이주의 형성 가능성이 높지 않은 것으로 확인됨
- 중화시험을 통해 면역반응성 차이 있는 변이주는 확인됨

나. 제2세부과제 : 재조합단백질 백신 제조기술 개발
1. 대장균 발현 구제역 재조합 항원의 확보
- 돼지용 구제역바이러스 O형, A형, Asia1형 및 3D 항원의 디자인이 완료되었다.
- BL21(DE3)를 이용한 생산 균주를 확보하였으며, 3R-IFC 및 F-3D 균주 등을 확보하였다.
2. 최적 면역보강제 확보
- ISA206이 mineral oil과 유사한 결과를 돼지 또는 기니픽 에서 확인하였으며, 보조아쥬반트로는 herbal extract가 좋은 결과를 보였다.
3. 단가 및 다가 백신의 제조
- O형, A형, O/A형 혹은 O/A/Asia1형 백신 개발, 항원량 및 백신제조공정의 최적화가 완료되었고, 특히 종배양 및 본배양 조건 조사가 완료되었음
- 항원단백질의 정제는 니켈 친화 크로마토그래피에 의한 정제조건조사를 완료
- 단백질의 단백질 분석은 SDS-PAGE를 통해 확인하고 단백질 정량법(Bradford)을 통해 정량하였음
- 최종적으로 백신을 제작하기 위한 조성과 함량의 결정이 완료됨
4. 신규 구제역 백신제조
- 2014년 7월 의성을 필두로 2014년 12월 진천 등지에서 구제역이 발생하였기 때문에 2010년 안동주와는 다른 진천주와 의성주에 유사한 백신 항원제작.
5. 신규백신의 기니픽에서의 면역원성 시험
- ELISA에 의한 항체가 측정에서 새로 개발된 항원은 기존 항원이나 바이러스 항원과 비교해 양성률이나 항체형성에서 동일한 수준을 보여 주었음
- 변이종 바이러스에 대한 항원의 개발은 항원 설계부터 백신 제조까지 약 2개월이 소요되어 신속한 백신개발이 가능함을 확인할 수 있었음.

다. 제3세부과제 : 대량공정의 시험백신 생산, 야외 농장 적용시험
1. 수용성 대장균 발현 항원의 확보
- 본 항원단백질을 수용성으로 발현하기 위하여 파로스백신으로부터 분양받은 BL21(DE3)의 벡터을 이용하여 목적단백질 유전자 앞부분에 maltose binding protein domain(MBP)을 도입하였으며, Ni-NTA affinity chromatography를 통해 순수한 단백질만 수득하여 전기영동으로 확인한 결과 정제수율은 83%이며, 농도 0.69㎎/㎖로 확인되었다.
2. Seed 확립 및 대량배양조건 확립
- 수용성으로 발현된 항원단백질(rFMD-O, A, Asia1, D)을 생산할수 있는 대장균의 표준배양방법을 확립하고, Master seed, Working seed을 확립하였다.
3. Adjuvant 결정
- Mineral oil, ISA206, Emulsigen-D, Eungen을 비교하였으며, 점도 및 결절형성력과 항체형성능력을 비교하였을 때 ISA206이 가장 적합한 Adjuvnat로 판단되었다. 또한 추가적으로 ISA201을 비롯하여 지속적인 Adjuvant 선발작업이 필요하리라 예상된다.
4. 시험백신의 항체형성능력 비교
- 2차에 걸쳐서 시험백신을 제조하였으며, 양성대조군으로 사용된 메리알의 백신에 비하여 결정형성은 낮으며, 거의 같은 수준의 항체형성능력을 갖는 백신을 제조할 수 있었다. 또한 수용성 항원을 확보함에 따라서 부족한 A type의 경우에는 보다 농축된 항원을 넣음으로써 메리알백신에 비하여 보다 우수한 항체형성능을 갖는 백신을 생산할 수 있으리라 예상된다.
5. 수용성 단백질의 평가
- 3차시험은 CAWIO의 평가 및 수용성으로 발현된 O형 항원 백신의 가치를 평가하기 위하여 시험되었음
- 아쥬반트 CAWIO의 경우에는 ISA206보다 우수한 항체형성능력을 확인할 수 있었으나, 결절형성 시험은 백신접종 2차 2주까지 거의 메리알 백신 수준으로 평가됨
- 항체를 형성은 이상없는 것으로 판단되었으며, adjuvant의 결정을 위해 Mineral oil, ISA206, ISA201, Emulsigen-D, Eungen, CAWIO를 비교하여 점도 및 잔류(결절형성)을 비교하였을 때 CAWIO은 항체형성 능력에서는 우수하나 결정형성에서 메리알 bulk vaccine(FMD-100)과 같은 수준임을 확인하였음
6. 아쥬반트의 평가
- ISA206은 점도 및 결정형성 능력에서는 우수한 것으로 확인되었으나, 메리알 bulk vaccine(FMD-100)에 비하여 낮은 항체형성 능력을 확인하였음
7. 돼지에서의 공격접종시험
- 돼지에서의 SPF 동물 백신접종 시험을 통해 2회후 면역 형성능 및 방어능 확인 결과 시제 백신 2그룹 모두에서 방어되지 않는 결과를 보였음
- 양성대조인 메리알 시험의 경우 모두 방어되는 결과를 보임
- 항원의 추가적인 조정이 필요할 것으로 판단됨

(출처 : 5. 최종 연구결과 요약 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
• 1. 연구배경 ... 5
• 2. 연구최종목표 ... 6
• 3. 연차별 연구개발 목표와 내용 ... 6
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• 1. 재 료 ... 7
• 2. 연구전략 및 방법 ... 7
• Ⅲ. 연구결과 ... 8
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 54
• Ⅴ. 고 찰 ... 57
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 ... 58
• IX. 참고자료 ... 59
• 끝페이지 ... 59