초록 ▼

인구고령화 시대에 직면하면서 퇴행성 뇌신경질환(파킨슨병, 알츠하이머병 등)의 유병율 역시 증가하고 있다. 하지만 증상완화의 치료가 진행될 뿐 근본적 치료제가 국제적으로 부재한 실정이며, 현재의 퇴행성 뇌질환 치료제는 전임상단계 모델로 동물을 이용하기 때문에 유전적· 표현형적 차이가 존재하여 실제 임상 결과와 현저한 차이가 발생한다. 이 문제를 극복하고자 인간 줄기세포 활용 연구가 주목받고 있으며 신약개발의 성공률 상승이 예측되는 분야이다. 그 예로 FDA에서는 이미 CPI 프로젝트(‘08년)를 통해 퇴행성 뇌질환 줄기세포치료제 개발

인구고령화 시대에 직면하면서 퇴행성 뇌신경질환(파킨슨병, 알츠하이머병 등)의 유병율 역시 증가하고 있다. 하지만 증상완화의 치료가 진행될 뿐 근본적 치료제가 국제적으로 부재한 실정이며, 현재의 퇴행성 뇌질환 치료제는 전임상단계 모델로 동물을 이용하기 때문에 유전적· 표현형적 차이가 존재하여 실제 임상 결과와 현저한 차이가 발생한다. 이 문제를 극복하고자 인간 줄기세포 활용 연구가 주목받고 있으며 신약개발의 성공률 상승이 예측되는 분야이다. 그 예로 FDA에서는 이미 CPI 프로젝트(‘08년)를 통해 퇴행성 뇌질환 줄기세포치료제 개발 연구를 수행하였고, 최근에는 인간 줄기세포 유래의 간·심장 오가노이드(조직 특성을 갖는 3차원 배아체)를 이용한 약물효과 예측 연구를 진행 중이라 밝혔다.

이에 본 연구에서는 환자 유래 세포를 활용하여 신약개발에 있어 임상평가 적용 가능성 검증을 목표로 뇌 오가노이드 연구를 수행하였다. 1차 년도에는 1) iPSC(induced Pluripotent Stem Cell: 역분화줄기세포)의 확보·유지·배양, 2) 중뇌(파킨슨병 관련) 오가노이드 분화법 확립, 3) 약물에 따른 반응 측정으로 진행되었다. 첫 단계로 iPSC 유지배양법 확립 후 Oct4, Nanog, AP 염색으로 미분화 특성을 검증한 후 오가노이드 분화에 적절함을 확인하였다. 두 번째 단계인 중뇌 오가노이드 분화는 줄기세포 상태, 세포내 유전자 등 다양한 원인으로 인해 분화법이 국제적으로 정립되어 있지 않아 검증에 어려움이 있었으나, 중뇌 오가노이드 관련 문헌자료와 국내 관련 전문가들의 자문을 통해 세포와 오가노이드 다양성을 감안하여 최종 방법을 확립하였다.

분화된 중뇌 오가노이드의 특성은 신경세포 관련 단백질(세포의 전구체, 성숙, 구조, 시냅스 관련 단백질)의 마커를 분자생물학적 방법인 면역조직염색, Real-time PCR, Western Blot, 뉴로멜라닌 염색을 통해 확인하였다. 이를 기반으로 파킨슨병 약물 치료제인 L-dopa의 약력학적 평가를 실시하였다. 이를 위해 도파민 분비능을 가진 오가노이드에 다양한 농도로 약물을 처리한 결과, 파킨슨병 환자 유래 오가노이드에서 L-dopa에 반응하여 일정수준까지 도파민분비량이 증가하는 것을 측정하였다.

2차 년도에도 동일하게 1) 정상인 및 알츠하이머 환자의 iPSC(induced Pluripotent Stem Cell: 역분화줄기세포)의 확보·유지·배양, 2) 대뇌(알츠하이병 관련) 오가노이드 분화법 확립, 3) 약물에 따른 반응 측정으로 진행하였다. 동시에 1차 년도에 확립한 중뇌 오가노이드의 분화법에 대한 재현성 시험을 진행하였다.

우선 재현성 확인에서는 줄기세포의 도파민성 중뇌 오가노이드로의 분화를 확인하였다. 또한 환자 유래 오가노이드에서 L-dopa 처리에 따라 dopamine의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며, 전기활성 역시 동일하게 L-dopa 처리에 따라 증가하는 것을 확인하였다.

대뇌 오가노이드 분화에 대한 방법은 중뇌 오가노이드와 유사하게 iPSC의 유지배양법, 대뇌 오가노이드 분화법 확립 그리고 신경세포 관련 단백질 마커를 확인하였다. 또한 알츠하이머병의 병리적 특징인 아밀로이드 베타 침착과, 인산화된 타우의 응집에 대해 분자생물학적 방법을 통해 확인하였으며, 오가노이드의 전기적 활성을 Multielectrode array를 통해 확인하였다. 이를 기반으로 알츠하이머병 약물 치료제 PQ912의 약력학적 평가를 실시하였다. PQ912는 동물시험에서 효과를 보였으나 실제 임상시험에서 효과가 미비한 것으로 나타나고 있다. 이에 알츠하이머 치료제로 알려진 beta-, gamma- secretase 억제제를 양성 대조군으로 사용하여 PQ912의 반응을 보았다. 양성 대조군의 결과 아밀로이드 베타의 발현이 감소한 것을 확인하였으나, 시험군인 PQ912에서는 감소하지 않는 양상을 확인하였다. 이는 동물시험보다 임상시험과 더욱 유사한 결과이며 오가노이드 모델의 약물평가 적용 가능성을 확인하는 계기라 할 수 있다.

이를 시작으로 향후 질환별로 다양한 세포주를 활용하여 의약품들의 약효평가에 대한 연구가 수행된다면 기존의 임상평가법의 한계를 극복하는 기반 연구가 될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 향후 의약품 인허가시 오가노이드를 이용한 전임상 평가 관련 기법에 대한 이해도를 높일 수 있을 것으로 기대된다.

(출처 : 요약문 3p)

Abstract ▼

Similar to growth of aging population, numbers of neurodegenerative disease patients are increasing in the elderly population. Parkinson's disease(PD) and Alzheimer's disease(AD) are such degenerative disorder of which etiology is unknown.
However, because animal models used in preclinical stages

Similar to growth of aging population, numbers of neurodegenerative disease patients are increasing in the elderly population. Parkinson's disease(PD) and Alzheimer's disease(AD) are such degenerative disorder of which etiology is unknown.
However, because animal models used in preclinical stages have genetic and phenotypic limitations, drug developments differ from clinical trial’s results. For this reason, FDA is already conducting research on the development of stem cell therapies for neurodegenerative disease in the CPI project, and is conducting research on predicting drug effects using organoids.

In this study, brain organoids were studied with the aim of verifying the applicability of clinical evaluation using patient-derived stem cells, expecially induced Pluripotent Stem Cell(iPSC). The research process consists of 3 steps: 1) maintenance culture of iPSC, 2) establishment of brain organoid differentiation method and 3) measurement of response change according to drugs.

First of all, we identified Oct4, Nanog and Alkaline Phosphatase as undifferentiated marker proteins. Next, the final differentiation method for midbrain organoid was estabilished through papers and consultation with experts. The organoids were characterized by molecular biological analysis of neuronal protein markers. Western blotting, Immunocytochemistry, Immunohistochemistry, neuromelanin staining, and electrophysiological technique were used as an analysis method. Finally, the amount of dopamine secretion was measured by the reaction of the organoid to L-dopa. As a results, dopamine secretion increased to a certain level n response to L-dopa in PD patient-derived organoids.

In the second year, the same method was used, and at the same time, a reproducibility test was conducted for the differentiation method of midbrain organoids established in the first year.

In the reproducibility confirmation, it was confirmed that stem cells differentiate into dopaminergic midbrain organoids. In addition, it was confirmed that the expression of dopamine was increased by L-dopa treatment in patient-derived organoids. And it was also confirmed that the electrical activity increased with L-dopa treatment.

Similar to midbrain organoids, iPSC maintenance, cerebral organoid differentiation, and neuronal protein markers were identified. In addition, the pathological characteristics of Alzheimer‘s disease, amyloid beta deposition, and aggregation of immobilized tau were confirmed through molecular biological methods, and the electrical activity of organoids was confirmed through multielectrode array.

Based on this, the pharmacodynamic evaluation of PQ912, a drug treatment for Alzheimer’s disease. was conducted. Although PQ912 showed an effect in animal studies, it was found to be insufficient in actual clinical trials. Therefore, the reaction of PQ912 was observed using a beta- or gamma- secretase inhibitor know as Alzheimer’s treatment as a positive control.

As a result of positive control group, it was confirmed that the expression of amyloid beta was decreased, but the pattern was not decrease in test group PQ912.
This is more similar to clinical trials than animal trials, and is an opportunity to confirm the applicability of the organoid model to drug evaluation.

Starting from this, if research on drug efficacy evaluation using various cell lines for each disease is carried out in future, it is believed that it will be a foundational study to overcome the limitations of existing clinical evaluation methods. In addition, It is expected that the degree of understanding of the technique related to preclinical evaluation using organoids when drug approval is granted in the future is expected.

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 5
• 목차 ... 7
• Ⅰ. 연구개발과제 연구결과 ... 8
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 8
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 14
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 18
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 143
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 146
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 147
• 제7장 참고문헌 ... 148
• 제8장 첨부서류 ... 151
• 별첨1. [SOP] 유도만능줄기세포(iPSC) 활용 중뇌 유사 오가노이드 분화법 ... 151
• 별첨2. [SOP] iPSC 활용 중뇌 오가노이드 분화 확인 시험법 ... 171
• 별첨3. [SOP] 인간 줄기세포를 이용한 대뇌 유사 오가노이드 분화법 ... 205
• 별첨4. [SOP] 줄기세포 유래 대뇌 오가노이드 특성 분석법 ... 223
• 별첨5. [SOP] 줄기세포 유래 오가노이드를 이용한 뇌질환 치료제 약력학적 시험법 ... 257
• 별첨6. [기술용역] 인간 유래 전분화능 줄기세포(iPS)유래 오가노이드 신경세포의 활성 측정 연구 ... 296
• 별첨7. [기술용역] 인간 유래 전분화능 줄기세포(iPS)유래 오가노이드 신경세포의 활성 측정 연구 ... 329
• 별첨8. [기술용역] 인간 역분화 줄기세포를 이용한 중뇌 오가노이드 재현성 확인 ... 342
• 끝페이지 ... 360