[보고서]애기장대와 식물 생장 촉진 내생균 Pseudomonas fluorescens간의 물리적 상호작용 인자 동정 및 역할 구명

김강민

애기장대와 식물 생장 촉진 내생균 Pseudomonas fluorescens간의 물리적 상호작용 인자 동정 및 역할 구명
The elucidation of the roles of physical interactors between Arabidopsis and plant growth promoting rhizobacteria, Pseudomonas fluorescens 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	전북대학교 Chonbuk National University
연구책임자	김강민
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-06
과제시작연도	2020
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO202100013606
과제고유번호	1345318458
사업명	개인기초연구(교육부)(R&D)
DB 구축일자	2021-09-11
키워드	애기장대.근권미생물.중금속 저항성.병 저항성.형질전환식물.물리적 상호 작용.Pseudomonas fluorescens.CRK4.fieF.

초록 ▼

□ 연구개요
식물 근권 및 조직에 내생하는 ‘식물생장촉진균 (PGPR)'이 분비하는 다양한 인자들과 상호작용하는 식물 인자들을 동정하고 그 생리적인 역할을 구명함으로써, 근권 생태계에서 일어나는 미생물과 기주 식물과의 교감을 분자 수준에서 이해한다. 이를 위해서 애기장대와 식물생장촉진균 Pseudomonas fluorescens들간의 물리상호 작용 인자들을 탐색, 동정하였고, 애기장대CRK4 유전자와 P. fluorescens유래의 PfFieF 유전자등의 신규 조절 인자들을 선별하여 이들의 생리적 역할 및 기능을 구명하였다.

□ 연구 목표대비 연구결과
• P. fluorescens의 ACC deaminase의 post-translational modification에 관여하는 애기장대인자 기능 분석 (애기장대 CRK4 유전자 선정)
- 다양한 조건 (NaCl, 세균처리, 식물 호르몬 처리)에서의 CRK4 유전자 발현 패턴 조사
- 식물의 cytokinin 신호전달회로와의 연관성 분석
- At CRK4 과발현 형질전환 애기장대 및 KO 계통 확보 및 전개
- CRK4의 생리적 기능연구 수행 (CRK4 과발현체: 생육증진 유도 기능 확인)
- CRK4 KO lines: 생육저해 확인
- CRK4의 NaCl 스트레스에 대한 저항성 증진 기능 확인 (발아율)
- CRK4의 병원성 세균 저항성 증진 기능 확인 (Pseudomonas syringae )
• Pseudomonas fluorescens와 Arabidopsis 상호작용 인자 특성 분석
- P. fluorescens와 Arabidopsis 인자들간의 yeast two hybrid 탐색 진행 (8개 클론 선별)
- 물리적 상호인자 후보군 중, 애기장대 (protein kinase)와 균 (Toll receptor)간의 물리적 상호작용 검증: false positive로 결론
- P. fluorescens에 감염된 Arabidopsis 줄기조직에 대한 RNAsequencing 수행 (5개 선별)
- P. fluorescens인자 중, FieF (cobalt-zinc-cadnium resistance protein) 유전자 선정및 기능분석 (애기장대에 내생하며 줄기에 FieF 발현)
- 중금속에 노출된 애기장대의 줄기에서 P. fluorescens FieF 유전자 발현 증가 확인
- FieF 인자 클로닝, 과발현 애기장대 과발현 형질전환체 구축
- P. fluorescens FieF 유전자가 애기장대의 Cd 및 Zinc 저항성 증대를 유도함을 확인

□ 연구개발결과의 중요성
• 애기장대 CRK4 인자의 중금속, NaCl, 생물학적 스트레스 저항성 및 적응성 조절 확인
• 식물의 근권 내생균인 P. fluorescens의 유전인자들의 근권 이외의 상층부 조직에서의 발현 확인
• 애기장대와 P. fluorescens간의 물리적 상호 인자 후보군 탐색 및 동정
• P. fluorescens의 발현 인자인 FieF 유전자가 식물의 중금속 저항성에 미치는 영향 확인
• 추후, P. fluorescens인자들을 활용한 애기장대의 생육 증진 및 병 저항성 확보에 대한 유전공학적 엔지니어링에 관련 지식 활용의 토대를 구축함

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
가. 총괄목표 ... 4
나. 핵심 연구 배경 및 가설 ... 4
다. 연구의 필요성 ... 4
라. 세부연구목표 ... 5
마. 연차별 세부 연구 목표 및 내용 ... 5
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 7
• 목표 1: P. fluorescens (Pt) ACC deaminase (PfACCD)의 post-translational modification에 관여하는 애기장대 (At) 인자 탐색 ... 7
• 목표 2: P. fluorescens (Pt)와 Arabidopsis 상호작용 인자 탐색 및 선정 ... 11
3. 연구개발결과의 중요성 ... 19
4. 참고문헌 ... 19
5. 연구성과 ... 20
끝페이지 ... 20

표/그림 (21)

표 The changes of protein degradation patterns of PfACCD-HA in presence of AtCRK4 PfACCD-HA and AtCRK4-Myc were co-expressed in Arabidopsis protoplast. In the designated time courses, cells were harvested and subject to immunoblot assay
표 The expression patterns of CRK4 gene in the various conditions
표 The CRK4 positively regulated the growth of Arabidopsis
표 CRK4 is necessary for the salt tolerance of Arabidopsis A, CRK4 OX lines showed the increase in germination and maintained growth under 100 mM NaCl. B, The germination rate of CRK4 related Arabidosis lines. CRK4 KO lines almost abolished the germination under 100 mM NaCl
표 CRK4 is necessary for developmental processe mediated by cytokinin in Arabidopsis A, CRK4 KO lines showed the marginal decrease in germination in presence of 100 nM of BAP, a kind of cytokinin working in Arabidopsis. CRK4 OX lines showed the slightly better growth than wild type and CRK4 KO lines. B, The germination rate of CRK4 related Arabidosis lines
표 Expression of cytokinin marker genes in CRK4 OX and KO Arabidopsis seedlings. A, The induction of two cytokinin responsive marker genes (AHK2, ARR7) according to treatment of BAP. B, The expression of cytokinin marker genes was increased in CRK4 OX lines
표 The phenotypical disease symptoms and residual bacterial population inside leaf tissues of Arabidopsis treated with Pseudomonas syringae . A, The leaf morphology and disease symptoms of Arabidosis leaves. B, The bacterial population of P. syringae inside Arabidopsis seedlings
표 The experimental scheme of yeast two hybrid screening for the interacting partners in Arabidopsis and Pseudomonas fluoresens
표 The pairs of candidate physical interactors between Arabidopsis and P. fluorescens
표 The roles of HUT1 gene in histidine metabolism in P . fluorescens
표 The expression of bacterial HUT1 gene in Arabidopsis shoot tissues treated with P. fluorescens in soil. Pf, positive control condition for HUT1 gene expression in which P. fluorescens were normally broth cultured
표 The RNA integration before and after clean-up mediated by RNeasy
표 The partial analyses of RNA sequencing of Arabidopsis infected with P. fluorescens A. The scatter plot of DEG between 1 day and 3rd day of infection. B. The Pie chart of DEGs. C. The bar graph of DEGs and their relevant cellular pathways
표 The partial analyses of genes of interest expressed inside Arabidopsis shoot tissue. A. The scatter plot of OTU. B. The list of genes of interest
표 Expression patterns of PfFieF in P. fluorescens treated with CdCl2. To verify that Cd induced oxidative stress in P. fluorescens, GST1 gene was used as marker gene for cellular oxidative stress. P. fluorescens rpoS (RNA polymerase sigma factor) was used as internal control for the RT-PCR
표 The expression cassette of pCB302 containing the Pf FieF genes
표 The accumulation patterns of PfFIEF-HA proteins in transgenic Arabidopsis lines. A. The protein level of PfFIEF-HA in four independent transgenic Arabidopsis lines expressing PfFieF genes. B. The protein of PtFIEF-HA transiently expressed in Arabidopsis protoplasts. For the transfection of protoplasts, 10 and 20 micrograms of PfFieF-HA containing plasmid (pHBT95:PfFieF) were used
표 The Cd resistance of Arabidopsis lines expressing PfFieF genes
표 The expression patterns of oxidative stress marker genes in Arabidopsis lines expressing PfFieF genes. Arabidopsis seedlings grown under healthy conditions were treated with different CdCl2 concentration for 6 hours. Seedlings were harvested and subjected to RNA isolation, followed by RT-PCR for designated marker genes. C, Col-0; #4, PfFieF line
표 The growth behavior of Arabidopsis seedlings expressing PfFieF genes. A. The representative seedlings grown under hydroponic conditions treated w/o and w/ 500 uM of Zinc chloride soln. B. The fresh weight measurement of Arabodopsis seedlings grown under hydroponic conditions. C. The representative seedlings grown in the pot treated with ZnCl2 for 30 days. D. The fresh weight measurement of Arabidopsis seedlings grown in the pots
표 The expression patterns of oxidative marker genes in Arabidopsis expressing PfFieF . Arabidopsis seedlings grown under healthy conditions were treated with different ZnCl2 concentration for 6 hours. Seedlings were harvested and subjected to RNA isolation, followed by RT-PCR for designated marker genes. C, Col-0; #4, PfFieF line

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