[보고서]비만성 지방간/간염증/간섬유화 제어를 위한 isorhamnetin의 바이오기능성 및 기전 연구

김추숙

비만성 지방간/간염증/간섬유화 제어를 위한 isorhamnetin의 바이오기능성 및 기전 연구
Study on the effect of isorhamnetin in obesity-induced liver diseases 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	울산과학기술원 Ulsan National Institute of Science and Technology
연구책임자	김추숙
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-06
과제시작연도	2020
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO202100013631
과제고유번호	1345315207
사업명	개인기초연구(교육부)(R&D)
DB 구축일자	2021-09-11
키워드	이소람넥틴.지방간성 염증.간섬유화.간세포.간성상세포.지질대사.비만.간질환.

초록 ▼

□ 연구개요
비알콜성 지방간질환은 비만인 사이에서 새로운 문제가 되고 있는 질환으로 단순한 간 내 지방축적에서부터 섬유화에 이르기 까지 광범위한 간 조직의 변화를 포함한다. isorhamnetin은 비만성 염증 및 간질환 개선 효과의 가능성이 높으나, 이러한 isorhamnetin의 생리 활성이 비만성 간질환 제어에 활용될 가능성에 대해서는 현재 보고된 바가 전혀 없다. 본 연구에서는 isorhamnetin의 비만성 간질환 (지방간증, 지방간염, 간섬유화) 개선효과 및 작용 메카니즘을 규명하고자 하였다.

□ 연구 목표대비 연구결과
제1차년도: 비만성 지방간증 및 간염 환경을 모방한 세포배양 모델계를 확립하여 비만성 간 질환의 진행 과정에서의 isorhamnetin의 효과를 규명한다.
• 지방축적 간세포 모델계: 유리지방산 (지방조직에서 유래) 자극에 인한 간세포 내 지질 축적 정도와 지질 대사 관련 유전자 발현이 감소됨.
• 간염/간섬유화 세포 모델계: 비만관련인자 (LPS, cytokines, H2O2 등) 자극에 인한 간성상세포(LX-2)의 활성화와 증식 정도 (a-SMC, TGF-b)를 대한 isorhamnetin 저해 효과를 확인함.
• 간세포/간성상세포 또는 간세포/간성상세포/대식세포 공동배양모델에서 isorhamnetin의 사이토카인 발현 및 단백질 분비능 (TNFα, TGF-b), 간섬유화 (a-SMA, collagen)를 억제됨.

제2차년도: 식이성비만쥐의 단순 지방간증 개선에 대한 isorhamnetin의 영향을 규명한다.
• 고지방식이로 9주간 사육한 지방간증쥐 (C57BL/6)에서 isorhamnetin 투여 (0.01% diet)에 따른 영향을 조사함.
• 체중변화, 지방조직, 간조직 및 주요장기조직 중량을 측정함.
• 간조직의 histochemistry분석,간 조직중 중성지질함량 측정함으로써 지방간증 개선을 확인함.
• 간 조직에서 지방대사관련 유전자 발현 (SREBP1, CHREBP, ACC1, FAS, PAPRs) 이 감소함.
• 지질산화 (AMPK), 미토콘드리아 바이로제네시스 (PGC-1a) 관련 단백질 발현이 증가함.
• 간조직 내 면역세포의 침윤 및 염증성 사이토카인이 감소함.

제3차년도: 지방간염 쥐모델계에서 간염과 간섬유화 개선에 대한 isorhamnetin의 영향을 규명한다.
• MCD로 4주간 사육한 지방간염쥐 (C57BL/6)에서 isorhamnetin 투여 (0.01% diet)에 따른 염증 및 섬유화 개선 효과을 조사함.
• 간손상정도(AST/ALT,TG)가 감소함.
• 간조직 중 염증성 사이토카인(TNFα, TGF-b, MMP9) 감소함.
• 염증신호전달분자 (NF-kB)의 활성화 정도가 억제됨.
• 간의 섬유화 정도(a-SMA, collagen, TGF-b), histochemistry (sirius red) 가 개선됨.

□ 연구개발결과의 중요성
1. 본 연구는 비만성 간지방증 및 간염증/섬유화 조절 측면에서 isorhamnetin의 효능과 작용 메커니즘을 밝히는 차원에서 매우 창의적이고 우수한 학문적 가치를 창출 할 것으로 기대된다.
2. 본 연구에서의 성과는 비만성 간질환에 개선 효과가 있는 신물질 탐색을 위한 시스템 구축차원에서 뿐만 아니라, 비만성 간질환 예방을 위한 기능성신소재 및 의약품 개발에 크게 기여 할 것으로 사료된다.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1-1. 국내·외 연구현황, 문제점 및 전망 ... 4
1-2. 연구개발의 필요성 ... 5
1-3. 최종연구목표 및 연구범위 ... 5
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 6
3. 연구개발결과의 중요성 ... 13
3-1. 학문적/기술적 파급효과 ... 13
3-2. 응용성/실용화 가능성 ... 13
4. 참고문헌 ... 14
5. 연구성과 ... 15
끝페이지 ... 16

표/그림 (12)

표 Effect of isorhamnetin on lipid accumulation in hepatocytes. Hepa1c1c cells exposed to FFAs (1mM) were treated with or without isorhamnetin (10-25uM) for 24h. (A) Representative images of Oil red O staining at 200x magnification in hepa1c1c cells. (B) Quantification of intracellular lipid content by triglycerides (TG) enzymatic assay in hepa1c1c cells. (C) Quantification of TBARS levels as a marker of lipid peroxidation in hepa1c1c cells. Data are presented as the mean ± SEM. ##p< 0.001compared with the FFA group
표 Effect of isorhamnetin on expression of gene/protein involved in lipid metabolism in hepatocytes. Hepa1c1c cells exposed to FFAs (1mM) were treated with or without isorhamnetin (10-25uM) for 24h. (A) Representative immunoblots for p-AMPK, and AMPK in hepa1c1c cells. (B) Relative mRNA expression levels of PPARa in hepa1c1a cells. (C) Relative mRNA expression levels of lipogenetic genes including ACC and FAS in hepa1c1a cells. Data are presented as the mean ± SEM. *p< 0.05, #p< 0.005, ##p< 0.001compared with the FFA group
표 Effect of isorhamnetin on inflammatory responses of fatty hepatocytes and/or cocultured fatty hepatocytes/macrophages. Hepa1c1c cells exposed to FFAs (1mM) were treated with or without 10uM isorhamnetin for 24h. (A) Relative mRNA expression levels of inflammatory cytokines (TNFa, IL6, and TGFb) in hepa1c1a cells. Data are presented as the mean ± SEM. *p< 0.05, **p< 0.01, #p< 0.005 compared with the FFA group. Co-culture of lipid-laden hepatocytes (2ｘ105cell/ml) and RAW 264.7 macrophages (8 ｘ 104 cells/ml) were incubated with or without isorhamnetin (10-25 uM) for 24h. (B) MCP-1 and TGFb concentration in the supernatant were determined by ELISA in cocultured lipid-laden hepatocytes/macrophages. Data are presented as the mean ± SEM. **p< 0.01, #p< 0.005, ##p< 0.001compared with the coculture group
표 Effect of isorhamnetin on obesity mediators (TGFb, FFA, LPS)-induced fibrosis in hepatic stellate cells. LX-2 cells exposed to 5ng/ml TGFb were treated with or without 2-50uM isorhamnetin for 24h. (A) Relative mRNA expression levels of fibrosis marker (Col1a1, a-SMA) in LX-2 cells. Data are presented as the mean ± SEM. **p< 0.05 compared with the TGFb group. (B) Level of a-SMA protein expression in LX-2 cells. (C) LX-2 cells exposed to FFA (1mM) were treated with or without 10-25uM isorhamnetin for 24h. Relative mRNA expression levels of fibrosis marker (TGFb, Col1a1, and a-SMA) in LX-2 cells. (D) LX-2 cells exposed to 100ng/ml LPS were treated with or without 10-25uM isorhamnetin for 24h. Relative mRNA expression levels of fibrosis marker (TGFb, Col1a1, and a-SMA) in LX-2 cells
표 Effect of isorhamnetin on fibrotic responses of cocultured fatty hepatocytes/hepatic stellate cells. (A) LX-2 cells were incubated for 4h in the presence of CM from HepG2 cells being treated with BSA or 0.4mM palmitate for 24h. Chemotactic migration of LX-2 cell induced by HepG-FFA-CM was measured using a chemotaxis chamber. Data are presented as the mean ± SEM. *p< 0.05, compared with the HepG-CM group. HepG2 cells exposed to 0.4mM palmitate for 24h. LX-2 cells were cocultured with fatty HepG2 for 24h in the presence or absence of 10-25uM isorhamnetin. (B) Relative mRNA expression levels of fibrosis marker (TGFb, a-SMA) in coculture fatty hepatocytes/hepatic stellate cells. (C) TGFb concentration in the supernatant were determined by ELISA in cocultured fatty hepatocytes/hepatic stellate cells. (D) Evaluation of MMP activity in coculture fatty hepatocytes/hepatic stellate cells was analysed by gelatin zymography assay. Data are presented as the mean ± SEM. *p< 0.05, ##p< 0.001 compared with the coculture group
표 Effect of isorhamnetin on body weight and adiposity in HFD-fed obese mice. C57BL/6 mice were fed a regular diet (HFD), or an HFD supplemented with isorhamnetin (Isor) for 9 weeks (n= 8-9 per group). (A) Experimental designs (B) B(RoDdy) , wae ihgihgth -gafaint d(iCe)t Food intakes (D) Adipose tissue weight. Data are mean ± SEM. **p< 0.01, #p< 0.005 versus HFD
표 Effect of isorhamnetin on hepatic lipid accumulation in HFD-fed obese mice. Livers were isolated from mice fed a regular diet (RD), a high-fat diet(HFD), or an HFD supplemented with isorhamnetin (Isor) for 9 weeks (n=8-9 per group). (A) Liver tissue weight (B) TG content in liver (C) Representative images of hematoxylin and eosin stained tissue. (D) Plasma alanine aminotransferase (ALT) levels. Data are mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, ##p<0.001 versus HFD
표 Effect of isorhamnetin on expression of gene/protein involved in lipid metabolism in HFD-fed obese mice. Livers were isolated from mice fed a regular diet (RD), a high-fat diet (HFD), or an HFD supplemented with isorhamnetin (Isor) for 9 weeks (n= 8-9 per group) .(A) Levels of phosphorylated AMPK and AMPK protein were determined by Western blotting. (B) Levels of PPARa protein were determined by Western blotting. (C) mRNA expression of lipogenetic genes (SREBP-1c, ACC and FAS) was quantified by real-time PCR. Data are mean ± SEM. *p<0.05, #p<0.005, ##p<0.001 versus HFD
표 Effect of isorhamnetin on expression of inflammatory cytokines in HFD-fed obese mice. Livers were isolated from mice fed a regular diet(RD), a high-fat diet(HFD), or an HFD supplemented with isorhamnetin (Isor) for 9 weeks (n=8-9 per group). Expression of (A) IL-1b (B)IL-6 and (c) TNFa mRNAs was quantified by real-time PCR. Data are mean ± SEM of 8-9 mice per group. *p<0.05, **p<0.01, #p<0.005 versus HFD
표 Effect of MCD diets on body weight, liver histology, and liver injury-related parameters in mice. C57bl/6 mice were fed the RD, HFD, MCD, or MCD supplemented with ISO for 4weeks (n=4-5 per group). (A) Body weight changes. (B) Liver sections were stained with H&E. Orignal magnification x100. liver TG (C) Plasma ALT and AST levels. Data are mean ± SEM of four mice per group. * p < 0.05, # p < 0.005 versus MCD
표 Isorhamnetin inhibits inflammatory responses in liver of MCD-fed mice. (A) Expression of TNFα, IL1β, and MCP-1 mRNAs were quantified by real-time PCR. (B) NF-κB activation was determined using the p65 TransAMassay as described in Materials and Methods.Data are mean ± SEM of four mice per group. * p < 0.05, ## p < 0.001 versus MCD
표 Isorhamnetin inhibits hepatic fibrosis in MCD-fed mice, as suggested by profibrotic gene expression level, Sirius red staining, and α-SMA expression level. (A) Expression of Collagen I, TGF-β1, and α-SMA mRNAs were quantified by real-time PCR. (B) Sirius red staining showed noticeable pericellular fibrosis in the MCD group. Representative liver sections from different groups. Original magnification x100. (C) Levels of a-SMA protein were determined by Western blotting. Data are mean ± SEM of four mice per group. *p<0.05, ##p<0.001 versus MCD

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