보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 Seoul National University |
연구책임자 |
김병준
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2021-03 |
과제시작연도 |
2020 |
주관부처 |
교육부 Ministry of Education |
등록번호 |
TRKO202100016565 |
과제고유번호 |
1345312496 |
사업명 |
이공학학술연구기반구축(R&D) |
DB 구축일자 |
2022-01-22
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초록
▼
□ 연구개발 목표 및 내용
○ 최종 목표
온도 민감성 Mycobacterium paragordonae 균주를 사용, Mycobacterium abscessus 감염 질환에 대한 예방 및 치료용 생백신 개발을 동물 모델에서 확인하고자 함.
○ 전체 내용
(1) 1차년도
■ 연구 목표
① Mycobacterium paragordonae의 안전성 평가
▶ In vitro에서의 안전성 평가
- 마크로파지 및 수지상 세포 감염 후 CFU 측정
- 마크로파지 및 수지상 세포 감염 후 세포 활성
□ 연구개발 목표 및 내용
○ 최종 목표
온도 민감성 Mycobacterium paragordonae 균주를 사용, Mycobacterium abscessus 감염 질환에 대한 예방 및 치료용 생백신 개발을 동물 모델에서 확인하고자 함.
○ 전체 내용
(1) 1차년도
■ 연구 목표
① Mycobacterium paragordonae의 안전성 평가
▶ In vitro에서의 안전성 평가
- 마크로파지 및 수지상 세포 감염 후 CFU 측정
- 마크로파지 및 수지상 세포 감염 후 세포 활성 평가: MTS, 7-AAD/Annexin V staining
▶ In vivo에서의 안전성 평가
- 누드 마우스 및 일반 마우스에 감염 후 장기 별 CFU 측정을 통한 안전성 평가
② Mycobacterium paragordonae에 의한 수지상 세포의 면역능 평가
▶ M. paragordonae가 감염된 마우스 유래 수지상 세포의 성숙 정도 평가
▶ M. paragordonae가 감염된 마우스 유래 수지상 세포의 사이토카인 발현 측정
▶ M. abscessus가 감염된 마우스의 T 세포와 M. paragordonae가 감염된 수지상 세포를 같이 배양시켰을 때, T 세포의 증식능을 비교 평가
■ 연구 내용
① Mycobacterium paragordonae의 안전성 평가
i) 마크로파지 및 수지상 세포에서 BCG와 M. paragordonae의 CFU assay
ii) 마크로파지 및 수지상 세포에서 BCG와 M. paragordonae에 의한 세포 독성 평가 (cytotoxicity assay)
- MTS assay, 7-AAD/Annexin-V staining assay
iii) 마우스에서의 M. paragordonae의 안전성 평가
- 정맥 주사(intravenous injection, I.V.) 및 비강내로 감염(intranasal injection, I.N.) 후, 시간대 별로 각 장기(간, 폐, 비장 등) 내 CFU를 측정함.
② Mycobacterium paragordonae에 의한 수지상 세포의 면역능 평가
i) 수지상 세포 성숙정도를 확인하기 위한 유세포 분석 평가 (flow cytometer assay)
- CD40, CD80, CD86, 및 MHC class II 분자의 발현 비교, 측정.
ii) 수지상 세포가 분비하는 사이토카인 측정
- TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12 등의 사이토카인에 대한 ELISA 및 real-time quantitative PCR을 수행.
iii) M. paragordonae에 의한 T 세포 증식 유도능 평가
- T cell proliferation assay by CFSE dilution method
(2) 2차년도
■ 연구 목표
▶ In vivo에서 M. paragordonae의 예방 백신 효과 평가
- M. paragordonae 백신 후, M. abscessus 균주 공격 시 다양한 면역학적 연구를 수행하여 M. paragordonae의 백신 가능성을 평가하고자 함.
■ 연구 내용
▶ In vivo에서 M. paragordonae의 예방 백신 효과 평가
- 동물 모델에서 M. paragordonae의 M. abscessus에 대한 예방 백신 효과를 확인하기 위해, 마우스에 4주 간격으로 총 2회 BCG와 M. paragordonae를 피하(subcutaneous injection, S.C)로 접종함. 그 후, M. abscessus 균을 미정맥(intravenous injection, I.V) 또는 비강내 접종(intranasal injection, I.N)하여 감염시킴. 감염 후, 2주와 4주 째에, 각각 동물을 희생시켜 다양한 면역학적 지표에 대한 실험을 진행함.
i) 장기 별 CFU 측정
- 시간에 따른 장기 (간, 폐, 비장 등) 별 CFU 측정.
ii) IFN-γ ELISPOT
- 비장세포의 in vitro stimulation 후, IFN-γ분비 세포수 확인 (spot forming unit, SFU).
iii) 사이토카인 발현 측정
- 비장세포의 in vitro stimulation 후, TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12 등의 사이토카인에 대한 ELISA 수행.
iv) 혈청 내 IgG 발현 양상 비교 분석
- 혈청 내 IgG2a 및 IgG1에 대한 ELISA 수행.
v) 조직 병리학적 평가
- 폐조직의 hematoxlin-eosin 염색(H&E staining)을 진행.
vi) 세포 독성 T 세포(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 유도능 평가
- CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit 사용.
(3) 3차년도
■ 연구 목표
▶ In vivo에서 M. paragordonae의 치료 백신 효과 평가
- M. abscessus 공격 후, M. paragordonae 면역 하여, 다양한 면역학적 연구를 수행하여 M. paragordonae의 치료 백신 가능성을 평가하고자 함.
■ 연구 내용
▶ In vivo에서 M. paragordonae의 치료 백신 효과 평가
- 동물 모델에서 M. paragordonae의 M. abscessus에 대한 치료 백신 효과를 확인하기 위해, M. abscessus를 마우스에 접종한 후 (I.V. or I.N. route), 2주 간격으로 총 2회 BCG와 M. paragordonae를 피하(subcutaneous injection, S.C)로 접종함. 최종 접종 후, 2주와 4주 째에, 각각 동물을 희생시켜 다양한 면역학적 지표 및 치료 효과에 대한 실험을 진행함.
i) 장기 별 CFU 측정
- 시간에 따른 장기 (간, 폐, 비장 등) 별 CFU 측정
ii) 마우스 생존 평가
- 최종 면역 후, 마우스의 생존 여부를 모니터링.
iii) 사이토카인 발현 측정
- 비장세포의 in vitro stimulation 후, TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12 등의 사이토카인에 대한 ELISA 수행.
iv) 혈청 내 IgG 발현 양상 비교 분석
- 혈청 내 IgG2a 및 IgG1에 대한 ELISA 수행.
v) 조직 병리학적 평가
- 폐조직의 hematoxlin-eosin 염색(H&E staining)을 진행.
□ 연구개발성과
○ Mycobacterium paragordonae의 안전성 평가
- 마크로파지 및 수지상 세포 감염 후 CFU 확인
- 마크로파지 및 수지상 세포 감염 후 7-AAD/Annexin V 염색하여 세포 사멸 확인
○ M. paragordonae에 의한 수지상 세포의 면역능 평가
- Mpg가 감염된 마우스 유래 수지상 세포의 성숙 마커 확인
- Mpg가 감염된 마우스 유래 수지상 세포의 사이토카인 발현 확인
○ In vivo에서 M. paragordonae의 예방 백신 효과 평가
- 면역시킨 마우스에서 M. abscessus의 장기별 CFU 확인
- 비장세포에서 M. abscessus 특이적인 IFN-γ ELISPOT 확인
- 비장세포에서 M. abscessus 특이적인 사이토카인 발현 확인
- 혈청 및 BALF에서 M. abscessus 특이적인 IgG 및 IgA 발현 확인
- 폐 조직에서 H&E 염색 확인
□ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
- 본 연구 과제 결과를 바탕으로 추후 Mpg의 M. abscessus 감염에 대한 치료용 백신 연구를 면밀히 진행하면, 전 세계적으로 비결핵 항산성 균종 중 높은 발병률을 보이며, 항결핵제에 저항성을 보여 치료가 어려운 M. abscessus에 대한 새로운 예방 및 치료용 백신 개발 연구에 활용할 수 있을 것으로 사료됨.
(출처 : 요약문 2p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 요약문 ... 2
- 목차 ... 5
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
- 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 6
- 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 6
- 1) 연구수행 결과 ... 6
- 2) 목표 달성 수준 ... 11
- 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 12
- 5. 연구개발성과 및 활용 계획 ... 12
- 1) 연구성과 ... 12
- 2) 연구성과 활용계획 ... 12
- 6. 참고문헌 ... 12
- 끝페이지 ... 12
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