[보고서]방사선 폐 섬유화 저해제 개발

나영화

보고서 정보

주관연구기관

차의과학대학교
CHA University

연구책임자

나영화

참여연구자

이윤실 , 조재호

보고서유형

1단계보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2018-07

과제시작연도

2017

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO202200002880

과제고유번호

1711058932

사업명

방사선기술개발사업

DB 구축일자

2022-06-18

키워드

방사선 폐섬유화.HSP27저해제.유효성평가.임상유사 동물모델.radiation-induced lung fibrosis.HSP27 inhibitors.validation evaluation.clinical relevant animal model.

표 새로운 신약개발의 패러다임 전화 (자체제작)
표 국내에서 HSP27을 대상으로 한 특허등록 현황
표 조직섬유화 과정에 대한 리뷰 (BBA, 2013)
표 HSP 관련 논문증가율 (좌) 및 특허등록 현황 (우)
표 Xanthone 화합물의 구조
표 Xanthone 화합물의 R1, R2 및 R3 구조에 따른 HSP27 단백질의 비이상적 이형화능 형성. NCI-H460세포에 Xanthone 화합물을 10 uM로 처리한후 12시간 후에 Western blotting을 실시하였고 HSP27의 비정상적 이형화능을 관찰함. Zerumbone (ZER)은 양성대조군으로 사용
표 비정상적 HSP27 이형화 생성능에 따른 Xanthone 화합물의 선정
표 비정상적 HSP25 이형화 밴드의 mass 분석에 의한 HSP25 단백 분석
표 SW15 화합물의 HSP27 단백질 특이적 및 용량 의존적 HSP27의 비정상적 이형화 형성능
표 SW15에 의한 이형화는 HSP27 cystein 잔기에서 일어남
표 SW15처리에 의한 HSP27 정상적 기능의 저해
표 스크리닝을 한 Chromone 구조 화합물의 구조 (A) 및 HSP27 단백질 (cell free system) 및 세포시스템 (NCI-H460 cell lysate) (B와 C)을 이용한 이형화 형성능 스크리닝 다양한 chromone 구조의 화합물 스크리닝을 통한 J2의 도출. (D) J2와 YK598-2의 MTT assay에 의한 세포독성 실험
표 J2는 SW15보다 비정상적 이형화 형성능이 좋았고 (A, B), HSP27 단백 존재하에서 이러한 비정상적 이형화를 유도하였으며 (C, D) 용량 의존적 HSP27 단백질 비정상적 이형화 형성능을 유도함 (E). NCI-H460 세포, shHSP27 발현 NCI-H460 세포 및 NCI-H1299세포에서 J2를 다양한 용량으로 처리한 후 HSP27 단백질의 비정상적 이형화를 Western blotting으로 관찰
표 90 Gy focal 방사선 조사에 의한 폐섬유화 정도를 폐조직의 Trichrome 염색 및 sirus red 염색을 통해 확인하였고 (위) HSP27 단백질 발현을 면역염색을 통해 확인 (아래)
표 90 Gy focal 방사선 조사한 마우스 폐조직의 Microarray 분석을 통한 섬유화 마커의 발현 변화
표 List of primers
표 90 Gy 방사선 노출 폐조직으로부터 mRNA를 분리하여 qRT-PCR를 수행함. 방사선 노출 4주간 fibronectin (FN1), MMP2, MMP12, Twist, IL1beta, IL6의 microarray data 및 1RT-PCR에 의한 정량결과
표 HSP27 knockdown에 의한 EMT 마커의 발현 변화. L132 lung fibroblast 및 NCI-H460 lung adenocarcinoma cell에서 HSP27을 knock down (shHSP27) 시킨 후 TGFbeta 처리에 의한 Western blotting과 real time RT-PCR을 통한 확인 (NCI-H460–위, L132 세포-아래)
표 HSP27 knockdown에 의한 EMT 마커의 발현 변화. L132 lung fibroblast 및 NCI-H460 lung adenocarcinoma cell에서 HSP27을 knock down (shHSP27) 시킨 후 방사선 (5Gy 및 10Gy) 처리에 의한 Western blotting과 real time RT-PCR을 통한 확인 (L132 세포-우, NCI-H460–좌)
표 A549 페암세포에 TGFbeta를 지속적으로 처리하였을 때 HSPs의 발현 및 EMT marker의 발현을 Western blotting으로 확인
표 HSP27을 knockdown (shHSP27)시킨 NCI-H460세포에서는 J2를 24시간 및 48시간 처리하였을 경우 방사선에 의한 EMT 억제효과가 나타나지 않음을 확인 (좌). TGFbeta를 A549 lung cancer cells에 지속적으로 처리하여 EMT를 진행시킨 세포 (A549TD)세포에 J2를 처리한 경우 EMT 진행이 저해됨을 확인 (우)
표 A: J2 처리에 의한 폐섬유화 저해 타겟 발굴: 정상마우스 폐, J2 (15 mg/kg)만 처리한 폐, 방사선 (75Gy, focal) 처리한 폐 및 방사선과 J2을 함께 처리한 폐조직을 적출하여 cDNA microarray를 실시한 결과 (좌) J2는 15mg/kg의 농도로 하루걸러 4주간 복강내 투어. twist, il1beta, il6를 대상으로 폐조직에서 qRT-PCR를 시행한 결과 (우), B: 방사선 조사후 4주후 적출한 폐조직에서 HSP27에 대한 면역염색 (위) 및 염색된 부분의 정량화 (아래)
표 Micro-CT 촬영을 통한 폐손상 평가 시스템 구축. 75Gy선량으로 6주간 방사선을 처리한 마우스. Top row : horizontal slice orientation. Middle row : trans-axial slice orientation. Bottom row : images of 3D micor-CT. 왼쪽 폐를 대상으로 Horizontal 또는 trans-axial orientation에서 consoldiation부분을 제외한 정상 폐조직의 volume을 측정한 결과 75Gy 6주 방사선 조사된 그룹에서의 정상 폐 볼륨이 감소됨을 확인함
표 Flexivent 장비를 통한 폐기능 평가 시스템 구축
표 The parameter description using flexivent system measurements
표 H&E 염색을 통한 폐렴, 폐섬유화 손상평가 시스템 구축. 75Gy 6주 마우스 모델에서 폐를 적출한 후 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킴. 조직을 탈수과정을 통하여 paraffin block을 만듬. paraffin block으로 만든 조직을 microtome을 이용하여 4㎛ 로 자름. slide glass 위에 조직을 올려, paraffin을 제거하고 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 시행
표 Trichrome 염색을 통한 폐렴, 폐섬유화 손상평가 시스템 구축. H&E stain과 동일하게 paraffin을 제거한 뒤, Masson’s Trichrome 염색하여 collagen 침착을 관찰함. 75 Gy 방사선 조사된 그룹에서는 control 그룹에 비해 intensive하게 collagen이 침착되어 있어 섬유화가 진행되었음이 관찰됨
표 방사선 선량별, 기간별 폐 조직의 Gross image. 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시켜 관찰함
표 방사선 75 Gy 조사후 HSP27 저해제 선도물질 NA1의 용량별 (0.15, 0.3 mg) 폐조직의 gross image. 6주후 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시켜 관찰함
표 방사선 75 Gy 조사후 HSP27 저해제 선도물질 NA1의 용량별 (0.15, 0.3 mg) 폐조직의 H&E staining. 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킨후 H&E staining 하여 관찰함. 좌 (10x) 우 (400x)
표 방사선 75 Gy 조사후 HSP27 저해제 선도물질 NA1의 용량별 (0.15, 0.3 mg) 폐조직의 gross image. 2주후 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시켜 관찰함
표 방사선 75 Gy 조사후 HSP27 저해제 선도물질 NA1 투여한 폐조직의 H&E staining. 2주후 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킨 후 H&E staining 하여 관찰함. 위 (20X), 아래 (400X)
표 방사선 75 Gy 조사후 HSP27 저해제 선도물질 NA1의 용량별 (0.15, 0.3 mg) 폐조직의 MT staining. 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킨 후 collagen 침착 특이 염색인 MT staining 하여 관찰함
표 방사선 75 Gy 조사 후 HSP27 저해제 선도물질 NA1 투여한 폐조직의 MT staining. 2주후 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킨 후 collagen 침착 특이 염색인 MT staining 하여 관찰함
표 H&E 염색을 통한 폐섬유화 - bronchiolar epithelium thickness 측정. 75 Gy 6주 후 H&E 염색을 통한 Bronchiolar epithelium thickness 측정 결과 75 Gy 방사선 조사된 그룹에서는 기관지 벽의 두께가 증가되어 있음을 확인하였음. 또한 NA1 0.3 mg에서 방사선에 의한 기관지벽의 두꺼워지는 현상을 억제함을 확인함
표 H&E 염색을 통한 폐섬유화-Arterial wall thickness 측정. 75 Gy 6주 후 H&E 염색을 통한 Arterial wall thickness 측정 결과 75 Gy 방사선 조사된 그룹에서는 혈관벽의 두께가 증가되어 있음을 확인하였음. 또한 NA1 0.3 mg에서 혈관벽의 두꺼워지는 것을 blocking함을 확인함
표 H&E 염색을 통한 폐렴 bronchiolar epithelium thickness, Arterial wall thickness 측정. 75 Gy 2주 후 H&E 염색을 통한 bronchiolar epithelium thickness, Arterial wall thickness 측정 결과 75 Gy 방사선 조사된 그룹에서는 혈관벽의 두께가 증가되어 있음을 확인하였음. 또한 NA1 0.3 mg에서 혈관벽의 두꺼워지는 것을 blocking함을 확인함
표 방사선 75 Gy 조사 후 HSP27 저해제 선도물질 NA1 투여한 폐조직의 H&E staining. 16주 후 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킨 후 H&E staining 하여 관찰함
표 H&E 염색을 통한 폐렴 bronchiolar epithelium thickness, Inflammation score 측정. 75 Gy 16주 후 H&E 염색을 통한 bronchiolar epithelium thickness, Inflammation score 측정 결과 75 Gy 방사선 조사된 그룹에서는 기관지벽의 두께가 증가되고 inflammation score가 증가되어 있음을 확인하였음. 또한 NA1 0.3 mg에서는 이러한 현상이 억제됨을 확인함
표 방사선 75 Gy 조사후 HSP27 저해제 선도물질 NA1 투여한 폐조직의 MT staining. 16주후 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킨 후 collagen 침착 특이 염색인 MT staining 하여 관찰함
표 75 Gy 2주, 6주, 16주에서의 inflammation score 및 NA1의 효과 비교
표 left-whole lung 방사선조사 폐렴 동물 모델
표 20Gy 방사선 선량에 의한 기간별 폐조직의 Gross finding. 마우스 왼쪽폐 전체에 20Gy의 방사선을 조사한 후 기간별로 마우스를 희생하여 10% formaldehyde를 이용하여 고정시켜 관찰함
표 20Gy 방사선 선량에 의한 기간별 폐조직의 H&E staining. 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킨 후 H&E staining 하여 관찰함
표 혈액 내의 사이토카인 측정
표 HSP25 유전자 과발현 마우스 모델
표 좌: HSP25 과발현 마우스 모델의 genotyping 과정, 우: HSP25 과발현 마우스 모델의 genotyping 결과. 마우스 2, 5, 6, 7번 마우스를 선별함
표 75Gy 방사선 선량에 의한 기간별 폐조직의 Gross finding. 마우스 왼쪽폐 전체에 20Gy의 방사선을 조사한 후 기간별로 마우스를 희생하여 10% formaldehyde를 이용하여 고정시켜 관찰함. IR : Irradiated hsp27 Wild type mouse, TG IR : Irradiated hsp27 transgenic mouse
표 75Gy 방사선 선량에 의한 폐조직의 H&E staining. 방사선 조사 후 2주, 6주 후에 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 10% formaldehyde를 이용하여 고정시킨 후 H&E staining 하여 관찰함. IR : Irradiated hsp27 Wild type mouse, TG IR : Irradiated hsp27 transgenic mouse
표 HSP27 wild type mouse (WT) 와 transgenic mouse (TG) 에서 HSP27 발현양 확인. 방사선 조사 전 마우스 폐를 이용하여 basal level에서의 HSP27의 발현량을 IHC로 확인함
표 방사선 조사된 HSP27 wild type mouse (WT) 와 transgenic mouse (TG) 에서 HSP27 발현양 확인. 방사선 조사 후 마우스 폐를 이용하여 방사선에 의한 HSP27의 발현변화를 IHC로 확인함
표 Massion’s Trichrome 염색을 통한 폐 손상평가. 마우스에 75Gy 방사선 조사 하고 1주 및 2주후에 마우스를 희생하여 Masson’s Trichrome 염색으로 collagen 침착을 관찰함. Transgenic mouse 그룹(TG+IR) 에서는 wildtype 그룹 (IR)에 비해 유의미하게 collagen이 침착되어 있어 섬유화가 진행되고 있음이 관찰됨
표 Massion’s Trichrome 염색을 통한 폐 손상평가. 마우스에 75Gy 방사선 조사 하고 6주후에 마우스를 희생하여 Masson’s Trichrome 염색으로 collagen 침착을 관찰함. Transgenic mouse 그룹(TG+IR) 에서는 wild type 그룹 (IR)에 비해 유의미하게 collagen이 침착되어 있어 Transgenic mouse엥서 섬유화가 더 많이 진행되고 있음이 관찰됨
표 75Gy 방사선 조사 8일(왼쪽), 18일(오른쪽) 후 WT, Transgenic mouse에서 Micro-CT 측정 결과. 왼쪽 폐를 대상으로 Horizontal 또는 trans-axial orientation에서 consoldiation부분을 제외한 정상 폐조직의 volume을 측정한 결과 방사선 조사후 8일째 transgenic mouse에서 정상 폐 체적이 더 많이 감소되어 있음을 확인함. Top row : horizontal slice orientation. Middle row : trans-axial slice orientation. Bottom row : images of 3D micro-CT
표 75Gy 방사선 조사 6주후 WT, transgenic mouse에서 micro-CT 측정 결과. 왼쪽 폐를 대상으로 Horizontal 또는 trans-axial orientation에서 consoldiation부분을 제외한 정상 폐조직의 volume을 측정한 결과 transgenic mouse에서 정상 폐 체적이 더 많이 감소되어 있음을 확인함. Top row : horizontal slice orientation. Middle row : trans-axial slice orientation. Bottom row : images of 3D micor-CT
표 방사선 조사된 HSP27 wild type mouse와 transgenic mouse에서의 폐기능 측정
표 HSP27 유전자조작 마우스에서 gross finding 및 H&E staining을 통한 hsp27 억제 후보물질의 폐섬유화 억제 효능 평가
표 HSP27 유전자조작 마우스에서 Micro-CT 촬영을 통한 hsp27 억제 후보물질의 폐섬유화 억제 효능 평가. 왼쪽 폐를 대상으로 Horizontal 또는 trans-axial orientation에서 정상 폐조직의 volume을 측정한 결과 transgenic mouse에서 정상 폐 체적이 더 많이 감소되어 있음을 확인함. 그러나 HSP27억제 후보물질 (J2)를 투여한 마우스에서는 정상폐체적이 일부 회복되었음. Top row : horizontal slice orientation. Middle row : trans-axial slice orientation. Bottom row : images of 3D micor-CT
표 HSP27 유전자조작 마우스에서 Flexivent system을 이용한 폐기능 측정에서 hsp27 억제 후보물질의 폐섬유화 억제 효능 평가
표 최적 투여시기 및 투여기간 정립을 위한 실험 디자인 모식도
표 HSP27 억제 후보물질 처리한 폐조직의 H&E staining – Inflammation score 측정 결과. IR: 75Gy 방사선만 조사한 그룹, IR+J2 4+2: 75Gy 방사선 조사 직후 HSP27 억제 후보물질을 4주 동안만 처리한 그룹, IR+J2 2+4: 방사선 조사 후 2주 이후부터 HSP27 억제 후보물질을 4주 동안 만 처리한 그룹, IR+J2 6: 75Gy 방사선 조사 후 HSP27 억제 후보물질을 6주 동안 처리한 그룹, J2 only: HSP27 억제 후보물질만 6주 처리한 그룹
표 HSP27 억제 후보물질 처리한 폐조직의 H&E staining – Bronchiolar epithelium, Arterial wall thickness 측정 결과. IR: 75Gy 방사선만 조사한 그룹, IR+J2 4+2: 75Gy 방사선 조사 직후 HSP27 억제 후보물질을 4주동안만 처리한 그룹, IR+J2 2+4: 방사선 조사 후 2주 이후부터 HSP27 억제 후보물질을 4주 동안만 처리한 그룹, IR+J2 6: 75Gy 방사선 조사 후 HSP27 억제 후보물질을 6주 동안 처리한 그룹, J2 only: HSP27 억제 후보물질만 6주 처리한 그룹
표 HSP27 억제 후보물질 처리한 폐조직의 Masson’s Trichrome staining 결과. IR: 75Gy 방사선만 조사한 그룹, IR+J2 4+2: 75Gy 방사선 조사 직후 HSP27 억제 후보물질을 4주 동안만 처리한 그룹, IR+J2 2+4: 방사선 조사 후 2주 이후부터 HSP27 억제 후보물질을 4주 동안만 처리한 그룹, IR+J2 6: 75Gy 방사선 조사 후 HSP27 억제 후보물질을 6주동안 처리한 그룹, J2 only: HSP27 억제 후보물질만 6주 처리한 그룹
표 HSP27 억제 후보물질 처리한 마우스의 micro-CT 측정 결과. IR: 75Gy 방사선만 조사한 그룹, IR+J2 4+2: 75Gy 방사선 조사 직후 HSP27 억제 후보물질을 4주 동안만 처리한 그룹, IR+J2 2+4: 방사선 조사 후 2주 이후부터 HSP27 억제 후보물질을 4주 동안만 처리한 그룹, IR+J2 6: 75Gy 방사선 조사 후 HSP27 억제 후보물질을 6주 동안 처리한 그룹, J2 only: HSP27 억제 후보물질만 6주 처리한 그룹
표 75Gy 방사선 조사 후 HSP27 억제 후보물질 처리한 마우스의 폐기능 측정 결과. IR: 75Gy 방사선만 조사한 그룹, IR+J2 4+2: 75Gy 방사선 조사 직후 HSP27 억제 후보물질을 4주동안만 처리한 그룹, IR+J2 2+4: 방사선 조사 후 2주 이후부터 HSP27 억제 후보물질을 4주동안 만 처리한 그룹, IR+J2 6: 75Gy 방사선 조사 후 HSP27 억제 후보물질을 6주 동안 처리한 그룹, J2 only: HSP27 억제 후보물질만 6주 처리한 그룹
표 Left-whole lung에 20 Gy 방사선 조사된 마우스 폐조직의 8개월, 12개월 Gross finding
표 마우스 left-whole lung에 20Gy 방사선 조사 후 8개월 된 마우스의 Micro-CT 결과
표 마우스 left-whole lung에 20Gy 방사선 조사 후 12개월된 마우스의 Micro-CT 결과
표 20Gy 방사선을 left-whole lung에 조사된 (8M) 마우스의 폐기능에서 HSP27 억제 후보물질의 효능 평가
표 방사선 폐섬유와 마우스 모델에서 H&E staining 결과를 통한 HSP27 억제 후보물질과 대조 약물 비교 결과
표 방사선 폐섬유와 마우스 모델에서 Micro-CT 결과를 통한 HSP27 억제 후보물질과 대조 약물 비교 결과. 왼쪽 폐를 대상으로 Horizontal 또는 trans-axial orientation에서 정상 폐조직의 volume을 측정한 결과 방사선에 의해 정상 폐 체적이 더 많이 감소되는 것이 HSP27 억제 후보물질(J2)를 투여한 그룹에서는 유의하게 정상폐체적이 회복되었음. 그러나 다른 대조약물에서는 그러한 효과가 없음을 확인하였음. Top row : horizontal slice orientation. Middle row : trans-axial slice orientation. Bottom row : images of 3D micor-CT
표 방사선 폐섬유와 마우스 모델에서 Flexivent system을 이용한 폐기능 측정 결과를 통한 HSP27 억제 후보물질과 대조 약물 비교 결과
표 방사선 75 Gy 조사 후 HSP27 저해제 HSP49 및 J2를 투여한 폐조직의 Gross finding. 마우스 왼쪽 폐에 75Gy의 방사선을 조사한 후 6주후에 마우스를 희생하여 10% formaldehyde를 이용하여 고정시켜 관찰함
표 방사선 75 Gy 조사 후 HSP27 저해제 HSP49 및 J2를 투여한 폐조직의 H&E staining (10X)
표 방사선 75 Gy 조사 후 HSP27 저해제 HSP49 및 J2를 투여한 폐조직의 H&E staining (40X) 및 Inflammation score. 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 4% paraformaldehyde를 이용하여 고정시킴. 조직을 탈수과정을 통하여 paraffin block을 만듦. paraffin block으로 만든 조직을 microtome을 이용하여 4㎛ 로 자름. glass slide위에 조직을 올려, paraffin을 제거하고 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 함
표 방사선 75 Gy 조사 후 HSP27 저해제 HSP49 및 J2를 투여한 폐조직의 H&E staining (10X)
표 방사선 75 Gy 조사 후 HSP27 저해제 HSP49 및 J2를 투여한 폐조직의 H&E staining (40X) 및 Inflammation score. 마우스에서 적출한 폐조직을 관찰하기 위해 4% paraformaldehyde를 이용하여 고정시킴. 조직을 탈수과정을 통하여 paraffin block을 만듦. paraffin block으로 만든 조직을 microtome을 이용하여 4㎛ 로 자름. glass slide위에 조직을 올려, paraffin을 제거하고 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 함
표 75Gy 방사선 조사 후 Micro-CT 측정 결과. 왼쪽 폐를 대상으로 consoldiation부분을 제외한 정상 폐조직의 volume을 측정한 결과. A : Horizontal slice orientation. B : Images of 3D micro-CT. C : Graph of Normal lung volume
표 75Gy 방사선 조사한 마우스에서 flexivent를 이용한 폐기능 측정 결과
표 75Gy 방사선 조사 후 면역염색을 통한 twist 발현확인. 마우스의 왼쪽 폐에 75Gy의 방사선을 조사하고 J2와 HSP49를 처리한 마우스 폐조직에서 면역염색을 시행하였음. A: magnification 40X, B: magnification 400X, C: Graph of Twist expression level
표 75Gy 방사선 조사 후 면역염색을 통한 a-SMA 발현확인. 마우스의 왼쪽 폐에 75Gy의 방사선을 조사하고 J2와 HSP49를 처리한 마우스 폐조직에서 면역염색을 시행하였음
표 L132 정상 폐세포에 shHSP27을 stably 발현하게 만들고 방사선 (5 Gy)에 의한 NFkB 활성화를 IkB 인산화로 확인하였고 Stat3 인산화 및 HSP27의 인산화도 Twist 발현과 함께 Western blotting으로 확인함 (좌). 또한 J2를 처리한 후 Western blotting을 확인함 (중간). shHSP27세포에 J2를 처리하고 p65 (NFkB component)의 핵으로의 translocation을 세포면역형광법으로 관찰 (우)
표 shControl 및 shHSP27이 이식된 L132 정상폐세포에 방사선 5Gy를 조사하고 Twist 및 HSP27의 발현을 면역형광염색으로 관찰
표 NFkB 저해제 BAY11-7082 처리 또는 sip65 transfection을 L132세포에 한 후 Western blotting한 결과 (A). IkBalpha와 HSP27의 결합에 대한 면역침전법 (IP) (B). siTwist를 L132세포에 처리한 후 qRT-PCR를 통한 IL-1beta 및 IL-6의 정량 (C). shHSP27을 stably 처리한 L132세포에서 cytosol과 nucleus를 분리한 후 Western blotting 한 결과 (E). L132 정상 폐세포에 sip65를 처리한 후 qRT-PCR 결과 (E). 정상마우스 및 HSP25 TG 마우스에 방사선 75Gy를 조사한후 폐조직을 대상으로 p-IkBalpha에 대한 면역염색결과 (F)
표 방사선 조사 (75 Gy) 폐조직에서 J2 처리유무에 따른 Twist, IL1-beta, IL-6의 발현을 면역염색으로 관찰하고 염색된 세포의 정량화 (위). L132 폐세포에 hsHSP27을 transfection한 후 방사선에 의한 Twist, IL-1beta, 및 IL-6의 발현을 qRT-PCR로 측정
표 방사선에 의한 폐섬유화 과정에 HSP27이 어떻게 관여하는가에 대한 그림. 방사선에 의해 활성화된 NFkB를 HSP27이 IkB와 결합함으로써 더 활성화시키고 이러한 활성화가 Twist, IL1-beta 및 IL-6의 발현과 관련있음
표 Bleomycin (2.5 mg/kg)을 마취후 intrachiral administration후 14일 및 21일에 부검하였고 J2 (3mg/kg)를 복강내 2일에 한번씩 주사하였음. 폐를 적출하여 Trichrom 염색을 실시함 (좌) 파란색으로 염색된 부분을 정량화 한 그림 (우)
표 Bleomycin (2.5 mg/kg)을 마취후 intrachiral administration후 14일 및 21일에 부검하였고 J2 (3 mg/kg)를 복강내 2일에 한번씩 주사하였음. 폐를 적출하여 HSP27 단백질 발현을 면역염색
표 HSP25 TG마우스에 Bleomycin (1.25 mg/kg)을 마취후 intrachiral administration후 14일 및 21일에 부검하였고 J2 (15 mg/kg)를 복강내 2일에 한번씩 주사하였음. 폐를 적출하여 HSP27 단백질 발현을 면역염색
표 정상마우스 및 HSP25 TG 마우스에 Bleomycin (1.25 mg/kg)을 마취후 intrachiral administration후 14일 및 21일에 부검하였고 J2 (15mg/kg)를 복강내 2일에 한번씩 주사하였음. 폐를 적출하여 Trichrom 염색을 실시함 (좌) 파란색으로 염색된 부분을 정량화 한 그림 (우)
표 NCI-H460 및 L132세포에 (shControl) shHSP27을 stable하게 knock down한 세포 (shHSP27)를 제작한 후 5nM TGFbeta 또는 방사선 처리 48 시간 후 세포모양을 현미경으로 관찰한 그림
표 TGFbeta 처리에 의한 J2의 EMT 마커발현 저해가 HSP27 특이적 현상임을 확인: NCI-H460 및 L132세포에 shHSP27을 stable하게 knock down한 세포를 제작한 후 J2를 10 uM로 처리한 후 5 nM TGFbeta를 처리하여 EMT 마커를 24시간 및 48시간 후에 Western blotting 또는 qRT-PCR로 확인
표 NCI-H460 폐암세포 및 L132 정상폐세포를 대상으로 한 세포사 및 Colony counting 측정. NCI-H460 세포 및 L132세포에 방사선 10Gy와 J2를 농도별로 같이 처리한 후 Flow cytometry법으로 세포사 측정 (위). J2를 처리한후 방사선 2Gy를 조사하여 Colony counting assay를 실시하여 14일후 나타난 Colony 수 측정 (아래)
표 Liver microsomal phase I stability (% of remaining after 30 min) (mean ± SD, n=3)
표 Liver microsomal phase I stability (% of remaining after 30 min) (mean ± SD, n=3)
표 Survival rate of J2 following caudal vein injection of a single dose to mice
표 Mean body weight curves of J2 following caudal vein IV single injection to mice. Bars represent the SD (n=4)
표 Survival rate of J2 following oral administration of a single dose to mice
표 Mean body weight curves of J2 following oral single administration to mice. Bars represent the SD (n=4)
표 Pharmacokinetic parameters of J2 following intravenous injection to rats
표 Mean plasma concentration-time curves of J2 following IV injections at a dose of 2 mg/kg (●) and 10 mg/kg (○) to rats. Error bars represent the SD (n=4-5)
표 HSP27 비정상적 dimer 형성능 스트리닝. 각 화합물 10 uM을 NCI-H460세포에 처리한 후 24시간에 Western blotting을 실시하여 HSP27, HSP90등을 확인
표 HSP49의 capsase-7 및 PAPR cleavage 관찰. 각 화합물 10 uM을 NCI-H460 세포에 처리한 후 24시간에 Western blotting을 실시하여 HSP27, HSP90, Caspare-7 및 PAPR cleavage 관찰
표 Toxicity and Metabolic Stability (in vitro)
표 CYP450 Inhibitory Effect Assay
표 Survival rate of HSP-49 following caudal vein Injection of a single dose to mice
표 Mean body weight curves of HSP-49 following caudal vein injection of a single dose to mice. Bars represent the SD (n=4)
표 Pharmacokinetic parameters of HSP-49 following intravenous injection to rats
표 Mean plasma concentration-time curves of HSP-49 following IV injections at a dose of 2 mg/kg (●) and 10 mg/kg (○) to rats. Error bars represent the SD (n=4-5)
표 Blemycin (BLM)에 의해 유도되는 폐섬유화 모델에서 J2 또는 HSP49 처리
표 BLM에 의한 폐섬유화 모델에서 J2 및 HSP49 처리에 의한 Collagen 축적능을 Tichrome 염색으로 확인함
표 BLM에 의한 폐섬유화 모델에서 HSP27의 발현정도를 immunohistochemistry로 확인함
표 BLM 처리에 의해 정상쥐 및 TG마우스에서 모두 증가를 보이는 Fibrosis 마커의 microarray 결과 (위) 및 qRT-PCR 결과 (아래)
표 NCI-H460세포 및 A549 폐세포에서 J2 및 HSP49의 HSP27 비정상적 이형체 형성능을 Western blotting으로 비교
표 실제 임상 예) 60세 환자, 방사선치료를 3차원입체조형치료법으로 66 Gy 까지 시행하여, 우측폐 상엽에 있던 종괴는 사라졌으나, 연이어 종양이 있던 부위 및 주변 정상조직에 심각한 기침 및 호흡곤란 증상을 동반한 방사선폐렴 발생을 상기 그림에서 보여주고 있음. 좌측 그림 - 치료 전, 가운데 그림 - 방사선치료 계획, 우측 그림 - 방사선조사 부위 발생한 폐렴
표 75Gy 2주 방사선폐렴 모델에서 gross finding 및 H&E staining을 통한 J2의 방사선폐렴 억제 효과
표 75Gy 2주 방사선폐렴 모델에서 micro-CT촬영을 통한 J2의 방사선폐렴 억제 효과
표 75Gy 2주 방사선폐렴 모델에서 flexivent system을 이용한 폐기능 결과
표 Clinicopathological characteristics of the patients
표 환자조직의 정상부위와 섬유화가 진행된 병변부위에서의 HSP27 발현양상
표 폐암환자 폐조직 정상부위에서 HSP27 발현정도
표 폐암환자 폐조직 섬유화 진행 부위에서 HSP27 발현정도
표 폐암환자 폐조직에서 섬유화 진행 정도에 따른 HSP27 발현양상 (100X)
표 폐암환자 폐조직에서 섬유화 진행 정도에 따른 HSP27 발현양상 (400X)
표 암세포 성장에서의 J2의 효과. In : HSP27 저해제, J2
표 H460 stem-like cell sphere formation에서 J2의 역할. HSP27 저해제: J2
표 orthotopic mouse lung cancer 모델 제작
표 orthotopic model에서 방사선 조사 부위
표 왼쪽 폐 전체에 60 Gy 방사선 조사 후 4주 (왼쪽), 6주 (오른쪽) 후의 마우스 폐의 Gross 및 H&E staining 결과
표 왼쪽 폐 전체에 75 Gy 방사선 조사 후 2주 (왼쪽), 4주 (오른쪽) 후의 마우스 폐의 Gross 및 H&E staining 결과
표 왼쪽 폐 전체에 90 Gy 방사선 조사 후 2주 (왼쪽), 3주 (오른쪽) 후의 마우스 폐의 Gross 및 H&E staining 결과
표 orthotopic lung cancer 마우스 왼쪽 폐에 90Gy 2주간 조사 후 gross finding 및 H&E staining 결과
표 Orthotopic mouse lung cancer 모델에서 방사선조사 및 J2에 의한 종양수 감소 결과
표 orthotopic mouse lung cancer model에서 방사선 조사의 종양영향 및 방사선 폐섬유화 영향 상호작용 및 상관성 분석을 위한 Masson′s Trichrome staining 결과
표 orthotopic mouse lung cancer 모델에서 HSP27 발현 결과
표 국가별 섬유화 질환 주요 출원인
표 국가별 폐 섬유증 주요 출원인

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과제기간(DetailSeriesProject) :	-
총연구비 (DetailSeriesProject) :	-
키워드(keyword) :	-
과제수행기간(LeadAgency) :	-
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방사선 폐 섬유화 저해제 개발
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