초록 ▼

연구개발 목표 및 내용
최종 목표
작물용 차세대 유전자 교정 시스템 개발

전체 내용
1. 유전자교정 효율 증진을 위한 작물용 CRISPR-Cas9 시스템 개발
- 토마토 Rubisco, actin, U6 프로모터 적용한 토마토 유전자교정용 벡터 제작
- tRNA가 삽입된 gRNA 발현 벡터 제작
- 토마토 codon optimized Cas9제작
2. 고추 적용 차세대 유전자교정 신육종기반기술 개발
- His-tagged 유전자가위 단백질 Cas9, Cpf1 분리 정제
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연구개발 목표 및 내용
최종 목표
작물용 차세대 유전자 교정 시스템 개발

전체 내용
1. 유전자교정 효율 증진을 위한 작물용 CRISPR-Cas9 시스템 개발
- 토마토 Rubisco, actin, U6 프로모터 적용한 토마토 유전자교정용 벡터 제작
- tRNA가 삽입된 gRNA 발현 벡터 제작
- 토마토 codon optimized Cas9제작
2. 고추 적용 차세대 유전자교정 신육종기반기술 개발
- His-tagged 유전자가위 단백질 Cas9, Cpf1 분리 정제
- in vitro cleavage assay를 통한 표적 DNA 절단으로 제작한 유전자가위 활성 평가
- PEG를 활용한 고추 원형질체로 CRISPR RNPs 전달
- 가지과 작물의 세포배양 방법에 대한 기반 실험 수행으로 고추 세포 배양법 구축
- CNTs/Silica 기반 표면 개질로 CRISPR Carrier 결합여부 Zeta poteintial 측정 확인
- CRISPR Carrier 전달을 통한 유전자교정 평가
- 고추 조직 기반의 식물체 재분화 조건 확립
3. 무 모자이크 바이러스를 이용한 배추 유전자교정 기술개발 및 VIGS 벡터를 이용한 배추의 Negative Regulator 선정
- RaMV Cas 9(1.6Kb, 1.3Kb) 발현 벡터 + RaMV Aptamer GFP guide RNA 발현 벡터의 N. benthamiana 접종에 따른 평가 진행
- Split sp Cas9(1.9Kb, 2.1Kb) 발현 RaMV 벡터 제작 및 발현 확인
- RaMV RNA2 내에 dual protein 발현 벡터 제작
- RaMV VIGS 벡터를 이용한 Negative Regulator 타켓 유전자의 선발에 다른 클로닝 및 배추 적용
4. 벼에서 HDR (Homology Direct Repair) 유전자 형질교정 기술개발과 효율증진
- Gemi-replicon, sgRNA, U3 promoter, CRISPR/Cas9, donor DNA를 이용 Ti-plasmid 구축
- 벼 embryogenic callus 선발, 감염, 재분화 및 형질전환체 조사

연구개발성과
1. gRNA 효율 검증법 확보 및 개선
2. 토마토 특이 프로모터의 효율성 검증
3. 토마토 안토시아닌 축적, 제초제 저항성, 연화지연 유전자 선발 및 유전자교정체 제작
4. 단고추와 매운고추 두 품종에 적용 가능한 고효율 유전자가위 선발 플랫폼 확립 및 고추 원형질체 기반 CRISPR/RNP 세포분열 조건 확립
5. 고추 조직 기반 CRISPR-Carriers의 비교 평가 완료
6. 고추 조직 기반 식물체 재분화 조건 확립
7. 두가지 (매운고추, 단고추) 고추 품종에서 조직 기반의 아그로박테리움 매게 형질전환 방법 비교 분석
8. 식물바이러스를 이용한 배추의 유전자 전달 및 제거에 관련된 생명공학 작물개발기술(세계 최초 개발, 기술이전 가치가 매우 높은 원천기술)
9. 벼에서 HDR 형질교정을 위한 식물 발현 벡터 구축 및 형질전환체 대량 육성

연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
1. 작물용 벡터 공유: 작물 유전자교정 연구효율을 증진시킬 수 있는 기초 재료로 활용
2. gRNA 효율 측정 방법 공유: 대량의 gRNA 분석
3. 활용될 프로모터와 Cas 단백질들의 각 작물에서의 기능성 및 적합성 자료 확보
4. 제초제 저항성 유전자 돌연변이 작물 생산을 통해 각 제초제들의 기능에 대한 기초연구 자료를 확보 및 제초제로 사용될 효율 높은 화합물 개발에 활용
5. 두가지 (매운고추, 단고추) 고추 품종을 바탕으로 확립한 유전자가위 효율 평가 플랫폼은 새롭게 개발되는 차세대 유전자가위 기술의 적용 가능성 및 효율성 평가에 폭넓게 활용 가능함
6. 확립한 유전자가위 평가 플랫폼을 통해 광범위한 병저항성의 주요 유전자인 CaMLO2 유전자에 적용 고효율 가이드 RNA에 대한 특허출원을 완료함 이를 바탕으로 병저항성 고추품종 개발에 활용 예정임.
7. 본 연구를 통해 확립한 단고추 Dempsey의 조직기반 재분화 조건은 다양한 유전자가위 전달 방법과 연결하여 신품종 고추 육종에 활용 가능함.
8. Radish mosaic virus(RaMV)를 이용한 배추 종자(배아) 유전자 교정기술 확립을 통한 신속한 기후변화 대응 채소 (배추) 육성 시스템 확립
9. 유전자가위를 이용한 유전자 편집 시스템의 개발로 목적유전자에 정확히 원하는 염기서열로 바꿔주는 knock-in system을 확립할 수 있음
10. 작물의 농업적 개량을 가능하게 하는 대표적 기술로 벼를 중심으로 고부가가치의 상업적 가치를 지니는 작물개발에 기여할 것으로 기대함

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요 약 문 ... 2
• 목차 ... 4
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 5
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행내용 ... 16
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 19
• 1) 연구 수행 결과 ... 19
• 2) 목표 달성 수준 ... 47
• 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 49
• 1) 목표 미달 원인(사유) 자체분석 내용 ... 49
• 2) 자체 보완활동 ... 49
• 3) 연구개발 과정의 성실성 ... 50
• 5. 연구개발성과 및 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 51
• 6. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 52
• 끝페이지 ... 54