초록 ▼

퇴행성 신경계 질환은 중추신경계 또는 말초신경계의 신경세포가 손상되거나 소실됨으로 인해 야기되며, 대표적인 질환에는 알츠하이머, 파킨슨병, 척수손상 등이 있다. 퇴행성 신경계 질환을 치료하기 위한 근본적인 치료법은 아직 마련되어 있지 않으며, 최근 줄기세포를 이용한 세포치료 제로 이를 극복하려는 연구가 전 세계적으로 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 신경줄기세포는 자가재생능력이 있으며 신경세포 등으로 분화가 가능하기 때문에 손상된 신경세포를 대체할 수 있는 근본적인 치료법이 되리라 기대하고 있으나, 국내에서는 아직 임상진입된 치료제

퇴행성 신경계 질환은 중추신경계 또는 말초신경계의 신경세포가 손상되거나 소실됨으로 인해 야기되며, 대표적인 질환에는 알츠하이머, 파킨슨병, 척수손상 등이 있다. 퇴행성 신경계 질환을 치료하기 위한 근본적인 치료법은 아직 마련되어 있지 않으며, 최근 줄기세포를 이용한 세포치료 제로 이를 극복하려는 연구가 전 세계적으로 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 신경줄기세포는 자가재생능력이 있으며 신경세포 등으로 분화가 가능하기 때문에 손상된 신경세포를 대체할 수 있는 근본적인 치료법이 되리라 기대하고 있으나, 국내에서는 아직 임상진입된 치료제가 없고 신경줄기세포에 대한 품질 및 안전성 평가법, 가이드라인 마련이 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 직접교차분화기술을 이용하여 신경줄기세포를 제작하고, 이들의 특성분석법 및 품질평가 지표들을 제안함으로써 관련 연구개발 및 허가심사 시 고려사항 등을 제공하고자 하였다.
신경줄기세포(neural stem cell, NSC)는 배아줄기세포나 유도만능줄기세포로부터 얻을 수 있으나, 윤리적 문제나 잠재적 종양원성 우려를 배제할 수 없다. 이러한 문제들을 극복하기 위해, 본 연구에서는 사람 섬유아세포에 Oct4, Sox-2, Klf4, c-Myc 유전자를 sendai virus vector를 이용하여 도입하여 신경줄기세포로의 직접교차분화를 유도하였다. 분화유도된 신경줄기세포(iNSC)의 특성을 확인하기 위하여 세포형태 관찰, 증식속도, 유전자 프로파일(short tandem repeat, STR) 분석, 신경줄기세포 관련 유전자 및 단백질 발현 분석 등을 실시하였다. iNSC에서는 신경줄기세포 특이적 마커인 PAX-6, N-cadherin이 잘 발현되었고, 반면 유도만능줄기세포 특이적으로 발현되는 NANOG, OCT-4, 섬유아세포 특이적으로 발현되는 COL1A1은 iNSC에서 발현되지 않았다. 또한 본 연구팀에서 확립한 신경줄기세포의 분화능을 확인하기 위하여 신경세포로의 분화를 유도시켰을 때, 신경줄기세포유래 신경세포(iNSC-Neuron)으로의 분화개시 7일째에는 수상돌기가 자라나옴을 관찰할 수 있었고, 분화 20일째에는 신경세포 특이적 마커인 Microtubule-associated protein 2와 Tubulin beta-3 chain의 발현을 immiunostaining으로 확인할 수 있었다. iNSC-Neuron의 전기생리학적인 특징은 Patch Clamp방법으로 확인하였으며, 신경세포 특이적인 action potential을 관찰할 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 본 연구에서는 사람 섬유아세포에서 신경줄기세포로 직접교차분화하는 방법을 성공적으로 확립하였으며, 유도된 신경줄기세포(iNSC)의 특성분석 및 품질평가 시험법을 확립하였고, iNSC의 확인시험 지표(PAX6, N-cadherin) 및 순도시험 지표(Nanog, Oct4)를 제시하였다. 각 지표에 대한 qPCR 및 유세포분석법을 제안하고 시험법 밸리데이션을 통해 SOP를 제공하였다. 본 연구결과는 신경줄기세포를 이용한 퇴행성 신경계 질환 치료제 연구개발 및 허가심사 시 고려사항 도출, 향후 가이드라인(안) 마련을 위한 유용한 기초자료로 활용되리라 기대한다.

(출처 : 요약문 3p)

Abstract ▼

Neurodegenerative diseases are caused by damage or loss of nerve cells in the central or peripheral nervous system, and representative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and spinal cord damage. There is no fundamental treatment yet for treating neurodegenerative diseases, and

Neurodegenerative diseases are caused by damage or loss of nerve cells in the central or peripheral nervous system, and representative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and spinal cord damage. There is no fundamental treatment yet for treating neurodegenerative diseases, and research to overcome them with cell therapy using stem cells has been actively conducted worldwide. In particular, neural stem cells are expected to be fundamental treatments that can replace damaged nerve cells because they have self-renewability and can be differentiated into nerve cells, but there are no clinical trials in Korea. The quality & safety evaluation and its related guidelines for neural stem cells are insufficient. In this study, neural stem cells were produced using direct reprogramming technology, and their characteristic analysis and quality evaluation markers were proposed to provide considerations for related R&D and approval review.
Neural stem cells (NSCs) can be obtained from embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, but ethical issues or potential tumorigenicity concerns cannot be ruled out. To overcome these problems, in this study, Oct4, Sox-2, Klf4, and c-Myc genes were introduced into human fibroblasts using a Sendai virus vector to induce direct reprogramming into neural stem cells. To confirm the characteristics of differentiated induced neural stem cells (iNSCs), cell morphology observation, proliferation rate, short-tandem repeat (STR) analysis, and neural stem cell-related gene and protein expression analysis were performed. In iNSC, the neural stem cell-specific markers PAX-6, N-cadherin were well expressed, whereas the induced pluripotent stem cell specifically expressed NANOG, OCT-4, and fibroblast specifically expressed COL1A1 were not expressed in iNSC. In addition, when differentiation into neurons was induced to confirm the differentiation ability of neural stem cells established by this research team, it was possible to observe the growth of dendrites on the 7th day of differentiation into neural stem cells-derived neurons (iNSC-Neuron). On the 20th day of differentiation, microtubule-associated protein 2, Tubulin beta-3 chain was detected by immunostaining. The electrophysiological properties of iNSC-Neuron were identified by the Patch Clamp method, and nerve cell-specific action potential was observed.
In this study, we successfully established a method of direct reprogramming from human fibroblasts to neural stem cells, established characteristic analysis and quality evaluation test methods of induced neural stem cells (iNSC), and presented confirmation test indicators (PAX6, N-cadherin, Oct4). qPCR and flow cytometry were proposed for each indicator, and SOP was provided through test method validation. The results of this study are expected to be used as useful basic data for suggesting considerations and preparing future draft guidelines in the R&D and approval review of treatments for neurodegenerative diseases using neural stem cells.

(source : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 5
• 목차 ... 7
• 연구개발과제 연구결과 ... 8
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 8
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 17
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 19
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 75
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 79
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 80
• 제7장 참고문헌 ... 82
• 제8장 첨부자료 ... 87
• 끝페이지 ... 147