초록 ▼

개인맞춤약물은 개인 간 차이(유전형 등)에 따른 약물반응을 고려하여 환자별 약물 선택 또는 용법·용량을 조절하는 것 등을 포함하는 개념이다. 이러한 접근 방식을 사용하면 예기치 않은 약물 관련 부작용이 발생할 위험을 줄이거나 최적의 약효를 기대할 수 있는 요법을 찾는데 도움이 될 수 있다. 따라서 생명을 위협하는 질환에 사용되는 항암제의 경우 개인맞춤약물 수요가 높으며 활발한 연구가 진행되고 있다. 5-Fluorouracil(5-FU)는 여전히 처방이 많은 의약품인 동시에, 전이성 대장암 환자에서 약물 내성에 따른 치료 실패가 주요

개인맞춤약물은 개인 간 차이(유전형 등)에 따른 약물반응을 고려하여 환자별 약물 선택 또는 용법·용량을 조절하는 것 등을 포함하는 개념이다. 이러한 접근 방식을 사용하면 예기치 않은 약물 관련 부작용이 발생할 위험을 줄이거나 최적의 약효를 기대할 수 있는 요법을 찾는데 도움이 될 수 있다. 따라서 생명을 위협하는 질환에 사용되는 항암제의 경우 개인맞춤약물 수요가 높으며 활발한 연구가 진행되고 있다. 5-Fluorouracil(5-FU)는 여전히 처방이 많은 의약품인 동시에, 전이성 대장암 환자에서 약물 내성에 따른 치료 실패가 주요 사망원인으로 지목되고 있다. 이에 따라 본 연구는 5-FU 내성 관련 생체지표 후보를 선정하고 이의 기능을 확인하기 위하여 수행되었다.

먼저 선행연구 및 문헌검색 결과 등을 통해 후보 생체지표를 선정하였다. 후성유전체학 분석을 통해 발굴된 SCLY와 단백질체학분석을 통해 발굴된 EZR, IMMT이 후보로 선정되었다. 이후 이들 생체지표의 생리·약리학적 기능을 탐색하기 위한 in vitro 모델로서 먼저 각 생체지표의 발현을 조절한 유전자 변형 세포주 모델(2D 및 3D 배양)을 구축하였고, 순차적으로 인체와의 유사성이 높아 임상적으로 활용 가능성이 높은 오가노이드 단독 배양 및 오가노이드-섬유아세포주 공배양 모델도 확립하여 5-FU에 대한 반응성(세포생존율 및 단백질 발현 변화 등)을 확인하는 방식으로 연구가 진행되었다.

2D 세포주 모델을 확립하기 위하여 7종의 대장암 세포주(HCT116, SW480, LOVO, DLD-1, SW620, HT29, HT15)에 5-FU를 처리하여 IC50과 후보 생체지표 유전자 발현량 변화를 확인하였다. 그 결과 생체지표 발현 변화가 가장 큰 HCT116가 기능연구를 위한 세포주로 선정되었다. 그 다음으로 3종의 각 생체지표의 발현을 억제 또는 과발현시킨 HCT116 대장암 세포주를 구축하였으며, 5-FU를 처리하여 세포생존율 변화를 확인하였고 RT-qPCR 및 Western blotting을 통해 생체지표 발현 변화도 확인하였다. 이들 유전자변형세포주에 5-FU를 처리한 결과, 유의미한 세포생존율 변화는 확인할 수 없었다. 하지만 3D 스페로이드(입체) 배양 모델에서는 5-FU 처리에 의해 스페로이드 크기 차이는 없었으나 EZR과 SCLY 발현이 억제된 세포주에서는, 스페로이드 가장자리가 무너지는 현상(세포사멸)이 관찰되었다. 따라서 이 3D 스페로이드 배양 시스템에서 차세대염기서열분석을 이용하여 5-FU 처리에 의해 특이적으로 반응하는 하위인자들을 분석하였다. 그 중 항암제 내성 관련 기전이 보고된 IFIT3, MMP7, IRF7을 유의미한 하위인자 후보로 발굴하였다. TCGA 분석 결과, 본 연구에서 선정한 생체지표 3종(EZR, SCLY, IMMT)과 하위인자 3종(IFIT3, MMP7, IRF7)은 모두 대장암 환자에서 높은 발현 경향을 보이는 것으로 나타났다.

그 다음 단계로 2D 및 3D 세포주 모델보다 임상적 연관성이 높을 것으로 예상되는 환자 유래 오가노이드(PDO) 및 섬유아세포주(CAF)와의 공배양 모델을 구축하였다. 확립된 PDO는 H&E 염색을 통해 장 기관 특성 및 조직 구조를 잘 유지하는 것을 확인하였다. PDO 단독배양 모델에서 5-FU에 대한 반응성을 확인한 결과, 5-FU 농도의 증가에 따라 세포사멸이 증가하였고 오가노이드 샘플 별로 상대적인 반응성 차이가 있음을 확인하였다. 면역형광염색 결과 5-FU 처리 시, 3종의 후보 생체지표 발현 수준 변화는 확인할 수 없었으나 하위인자 중 MMP7은 감소 IFIT3는 발현이 증가하는 경향을 보였다.

마지막으로 PDO-CAF 공배양 모델을 확립하였고, 이 시스템에서는 암미세환경이 약물반응에 미치는 영향을 탐색하고자 하였다. 확립된 PDO 중 세포배양 안정성 및 약물 반응성을 고려하여 2종의 PDO를 선정하여 이후 실험을 진행하였다. CAF와 공배양한 PDO에서는 단독배양 PDO보다 IFIT3의 발현이 증가되었고, 5-FU를 처리한 CAF 공배양 PDO에서 MMP7의 발현이 감소하였으며 IFIT3도 발현 양상 변화가 있었다. 암미세환경이 PDO에 미치는 영향을 좀 더 상세히 확인하기 위하여 cytokine array를 수행하였으며, CAF와 공배양 시 전반적으로 암이나 면역반응 관련 cytokine의 발현 수준이 증가하는 경향을 보였다. 이는 공배양 시스템이 인체와 가장 유사한 항암제 반응 평가 모델로서 가능성이 있음을 보여주는 결과로 사료된다.

이상 실험결과 등을 종합하였을 때, 후보 생체지표와 관련하여 2D 세포주 모델에서 EZR, IMMT, SCLY의 기능을 탐색하였으나 세포사멸억제와 큰 연관성은 확인하지 못하였으나 일부 생체지표 발현조절 세포주에서 5-FU에 대한 반응성 차이를 보였던 3D 배양 모델에서 전사체 분석을 통해 하위인자 IFIT3, MMP7, IRF7을 발굴하였다. 세포주 모델보다 인체와의 유사성이 높아 임상적으로 활용 가능성이 높은 PDO 모델과 PDO-CAF 공배양 모델을 이용한 기능 연구에서 내성 생체지표로서 IFIT와 MMP7의 가능성을 확인하였다. 특히 세포사멸을 억제하는 IFIT3가 PDO-CAF 공배양 모델에서 발현이 증가되었으며 CAF와 관련하여 5-FU 내성 획득에 관여할 것으로 예상된다. 이 연구를 통해 총 4종의 항암제 내성 평가 시스템 (2D 및 3D 세포주, PDO 단독배양, PDO-CAF 공배양 모델)을 확립하였으며 이는 개인맞춤약물을 위한 약물반응평가 시험법으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

The precision medicine is about tailoring dose regimen to individual patient based on the concept of inter-individual variation of drug response. In particular, individual's genetic characteristics are reported to be one of variables that influence the pharmacological aspects of patient's drug respo

The precision medicine is about tailoring dose regimen to individual patient based on the concept of inter-individual variation of drug response. In particular, individual's genetic characteristics are reported to be one of variables that influence the pharmacological aspects of patient's drug response. Therapeutic application of personalized medicine may reduce incidences of drug related side effects on a population basis while also promote the discovery of dose regimen that best fits for the patient.

5-Fluorouracil (5-FU), one of kind drug patented in 1956 is still widely prescribed for chemotherapy regimen. However, Blondy and colleagues (2020) has reported that 5-FU resistance (innate or acquired) may be cause of treatment failures in metastatic cancers. Here, we selected and evaluated functions of SCLY, EZR and IMMT as candidate biomarkers of 5-FU drug response in colon cancer. SCLY was found in our epi-genomic analysis of 5-FU non-responders, while, EZR and IMMT were discovered in our proteomic analyses of highly expressed proteins in a colon cancer organoid.

Through literature search, we concluded the functional role of SCLY, EZR, and IMMT in colon cancer has not been reported extensively. In case of EZR and IMMT, their elevated expressions in different types of cancers are reported to increase the likelihood of developing vascular invasion of cancer. To investigate the functional role of these biomarker candidates, we analyzed IC50 of seven types of colon cancer cell lines (namely, HCT116, SW480, LOVO, DLD-1, SW620, HT29, HT15) after 5-FU treatment. We selected HCT116 as a colon cancer cell line for the functional study, which showed drastic changes of expression levels and drug responsiveness of the biomarker candidates.

Next, as an in vitro model of functional study, gene over-expression and gene knock down cell lines for EZR, IMMT and SCLY in HCT116 were established. We confirmed successful establishment of these cell lines by checking expressions of biomarker candidates via RT-qPCR and Western blotting.

Using the established in vitro model, we tested the functional role of biomarker candidates. When we treated 5-FU in established cell lines, no significant cell survival effect was observed compared to that of control. However, we predicted such result may be due to the limitation of 2-dimentional culture cell model. Thus, we tested 5-FU drug response in newly developed 3-Dimensional spheroid culture model in notion that 3D model is more physiological relevant than 2D model. We found no significant difference in size of biomarker candidate overexpressed or knockdown spheroids. However, EZR and SCLY knockdown spheroids showed 'blurry boundary' effect in 5-FU treated conditions, suggesting the role of EZR and SCLY in inhibiting cell death.

Then, we used Next generation sequencing method to discover downstream genes that respond to 5-FU treatment in the established 3D spheroids. we discovered IFIT3, MMP7, and IRF7 that are already known for the role in anti-cancer drug resistance related mechanisms in previous studies. Moreover, three biomarkers (EZR, IMMT, SCLY) we evaluated throughout the study as well as their 5-FU responsive downstream genes (IFIT3, MMP7, IRF7) all showed tendency to highly express in tumors compared to normal tissue when we analyzed TCGA datasets of colorectal adenocarinoma (COAD).

In order to evaluate functions of candidate biomarkers and their 5-FU responsive downstream genes, we established immortalized cell lines of Cancer associated fibroblast (CAF) as well as Patient derived organoid (PDO) which is considered to be more clinically relevant compared to that of 3D spheroid. We confirmed that PDOS we established maintain typical colon tissue specific features via Hematoxylin & Eosin (H&E) staining. When we tested 5-FU drug responsiveness of established PDO model, we confirmed dosage dependent cell death. Using Z-score analysis, we found variations in 5-FU responsiveness among PDOS, suggesting inter-individual variations. In addition, immunofluorescence analysis of PDOS indicated that upon 5-FU treatment, MMP7 tends to decrease while IFIT3 tends to increase.

Lastly, to investigate effects of tumor microenvironment on 5-FU responses of PDO, we established PDO-CAF co-culture model. We found that without drug treatment, IFIT3 expressions of co-cultured PDOS were elevated compared to that of mono-cultured PDOS. When we treated 5-FU, we found MMP7 expressions of co-cultured PDO showed reduction, while IFIT3 expressions of co-cultured PDO compared to that of mono-cultured PDO varied between PDOS suggesting inter-individual variations. To understand the effect of tumor microenvironment on PDO, we compared the cytokine levels between mono-culture and co-culture model. As predicted, we found that PDO-CAF co-culture model show overall increase in cytokines compared to that of PDO mono-culture model, suggesting increased levels of cytokines may be mode of action for tumor microenvironment to promote or inhibit the growth of the tumor.

In this study, we established 2D and 3D cell line model to search for the functions of EZR, IMMT and SCLY, however, we could not find the strong evidence supporting relevance of these biomarker candidates to apoptosis inhibition. However, through transcriptomic analysis, we discovered IFIT3, MMP7, and IRF7 as 5-FU responsive downstream genes of EZR, IMMT and SCLY, respectively. Using more clinically relevant PDO and PDO-CAF model, we confirmed the potential of IFIT3 and MMP7 as 5-FU resistance marker. IFIT3, which known for its apoptosis inhibitory function, is highly expressed upon PDO-CAF expression. This suggests probable role of CAF in promoting acquisition of 5-FU resistance of cancer cells. In summary, we laid foundations for advancing drug response evaluation by establishing four types of anti-cancer drug resistance evaluation platforms (2D cell model, 3D cell model, PDO culture model, and PDO-CAF co-culture model).

(source : Summary 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 4
• Summary ... 6
• 목차 ... 8
• 그림목차 ... 11
• 표목차 ... 14
• I. 연구개발과제 연구결과 ... 16
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 16
• 제1절 연구개발과제의 목표 ... 16
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 16
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 23
• 제1절 국내외 암 발생 현황 ... 23
• 제2절 항암제 개발 현황 ... 29
• 제3절 오가노이드 개발 현황 ... 34
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 36
• 제1절 후보 생체지표 선정 및 문헌 조사 ... 37
• 제2절 in vitro 실험을 위한 세포주 선정 및 실험 조건 확립 ... 44
• 제3절 in vitro 실험을 위한 유전자 변형 세포주 구축 ... 58
• 제4절 3차원 배양 세포주를 활용한 in vitro 모델 시험 ... 75
• 제5절 환자 유래 대장암 오가노이드 및 암 연관 섬유아세포의 확립 및 특성 분석 ... 110
• 제6절 환자 유래 암 오가노이드 및 단독 배양 모델 시험 ... 132
• 제7절 환자 유래 암 오가노이드 및 암 연관 섬유아세포의 공배양 모델 시험 ... 163
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 187
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 190
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 191
• 제7장 참고문헌 ... 194
• 제8장 첨부서류 ... 201
• 끝페이지 ... 208