초록 ▼

신변종 바이러스 출현에 대비한 치료제 개발은 공중보건학적으로 매우 중요하나, 병원체의 특성으로 인하여 특수 생물안전밀폐실험실 (BL3 및 BL4)이 요구되어 치료제 발굴에 어려움이 있음. 이에 본 과제는 BL2에서 적용 가능한 신변종·고위험 바이러스 치료물질의 신속대량 약물검색법(HTS)을 이용한 치료제 선별 플랫폼 개발 및 최적화와 코로나19 등 신변종·고위험 바이러스 치료 후보물질 발굴 및 기전확인을 목표로 함.

-본 연구과제는 drug repositioning을 이용한 약물검색을 위하여, FDA 승인 약물 라이브러

신변종 바이러스 출현에 대비한 치료제 개발은 공중보건학적으로 매우 중요하나, 병원체의 특성으로 인하여 특수 생물안전밀폐실험실 (BL3 및 BL4)이 요구되어 치료제 발굴에 어려움이 있음. 이에 본 과제는 BL2에서 적용 가능한 신변종·고위험 바이러스 치료물질의 신속대량 약물검색법(HTS)을 이용한 치료제 선별 플랫폼 개발 및 최적화와 코로나19 등 신변종·고위험 바이러스 치료 후보물질 발굴 및 기전확인을 목표로 함.

-본 연구과제는 drug repositioning을 이용한 약물검색을 위하여, FDA 승인 약물 라이브러리와 임상 라이브러리를 비롯한 총 4개, 12,800종의 약물 라이브러리를 구축함. 추가로 화합물의 구조적 공통점이 항바이러스 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여 한국화합물은행의 대표 화합물 라이브러리 (6,900여종)를 연구과제 내 스크리닝에 적용함. 구축된 라이브러리를 이용하여 총 3가지 평가법인 PLpro substrate peptide-fluorescence 평가법, alpha-assay 평가법 및 슈도바이러스 기반 항바이러스제 평가법에 대한 치료제 선별 플랫폼을 개발하고 코로나바이러스 치료 후보물질을 발굴함.

-PLpro substrate peptide-fluorescence 평가법을 구축하기 위하여 PLpro 단백질을 자체적으로 생산하여 효율적인 평가를 위한 평가법 최적화를 수행함. 최적화된 평가법을 기반으로 총 12,800종의 약물 스크리닝을 진행하였으며, 총 6개의 hit compound를 확보함. 또한, 한국화합물은행의 대표 화합물 라이브러리를 이용하여 6,948종의 약물에 대한 스크리닝을 추가로 수행하여, 5개의 추가 hit compound를 확보함(목표 초과 달성). 확보된 각 hit compound는 약물의 독성평가 및 BL2 수준에서의 항바이러스 효과를 확인하였으며, 현재 molecular docking을 완료하였고 유비퀴틴 저감화 저해 효과, PLpro와의 co-crystalization 등 약물의 작용기작을 검증하는 과정 중에 있음.

-Alpha assay를 이용한 평가법의 구축을 위하여 평가법에 사용되는 주요 단백질인 코로나바이러스의 spike-protein (S-protein)과 ACE2 protein을 자체적으로 생산하고 생산과정을 최적화하는 과정을 수행함. S-protein 및 ACE2 대량생산 후 alpha assay 기반 스크리닝을 최적화하였으며, 최적화된 조건으로 FDA 승인 약물에 대한 스크리닝을 수행하여 70% 이상의 inhibition을 보이는 약물을 12개를 확인함. 이 중 독성이 알려진 약물을 제외하고 2~4개의 hit compound를 지속 연구 진행함.

-슈도바이러스 기반 스크리닝 시스템의 구축을 위하여 코로나19 슈도바이러스 및 세포주를 제작하고, 이후 항바이러스 효과가 이미 알려진 remdesivir와 같은 약물을 이용하여 스크리닝 시스템의 최적화를 수행함. 최적화된 스크리닝 시스템을 이용하여 총 4,304종에 대한 약물 스크리닝을 완료하고 (목표 초과 달성), 1차년도 pilot 스크리닝과 최종 스크리닝에서 각각 hit compound 7개, 10개를 확보함. 확보된 hit compound는 각각 Dose respond curve 및 세포독성을 평가하였으며, 문헌 조사를 통하여 신규 후보물질을 선별함. 이후, Hit compound의 항바이러스 기전을 확인하기 위한 연구들을 진행하였으며, alpha assay 결과 3개의 hit compound는 s-protein과 ACE2 결합을 저해하는 작용 기전을 가지는 것을 확인함. 이외의 다른 hit compound의 작용 기전을 확인하기 위하여 RNA-seq, metabolomics 분석 및 BL3 시설에서 SARS에 대한 항바이러스 효능 확인 연구를 수행 중임.

(출처 : 요약문 5p)

Abstract ▼

· Development of drug screen system
- Selection of a specific cell-line expressing the receptor of SARS-CoV2, ACE2
- Optimization of pseudovirus infection on the cell-line expressing the ACE2 by modulating multiplicity of infection( MOI) and feasible conditions.
- Purification of recombinat

· Development of drug screen system
- Selection of a specific cell-line expressing the receptor of SARS-CoV2, ACE2
- Optimization of pseudovirus infection on the cell-line expressing the ACE2 by modulating multiplicity of infection( MOI) and feasible conditions.
- Purification of recombination PLpro from bacteria.
- Development and HTS optimization of in vitro screen platform targeting the PLpro using AMC
· HTS Drug Screen
- Preparation of drug/compound libraries including anti-HIV drug (lopinavir, ritonavir), anti-ebolavirus drug(remdesivir), antiviral drug library form the FDA approved collections from Sellekchem (~ 500 compounds).
- HTS using the pseudovirus infection system : finished 4,304 compound screen
- HTS using AMC-assay targeting PLpro : finished compound screen over 19,000 ( 12,800 + 6,948)
- HTS using ALPHA assay: finished compound screen using FDA-approved library : 2-4 hits

· Validation of positive hits and mechanism of action
- Measurement of antiviral effect of the selected hits both by using the human coronavirus(HCoV-229E/HCoV-OC43) and cell-line( e.g. VERO cell), and by quantifying viral mRNA during the viral infection(qRT-PCR).
- Measurement of antiviral potency agasint SARS-CoV-2
- Molecular docking using PLpro to predict potential binding pose
- Measurement of key metabolites during drug treatment

(source : Summary 7p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 5
• Summary ... 7
• 학술연구개발용역과제 연구결과 ... 8
• 제1장 최종 목표 ... 8
• 제2장 국내외 기술 현황 ... 11
• 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 14
• 제4장 최종 연구 결과 ... 23
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 64
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 65
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 69
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 69
• 제9장 연구비 사용 내역 및 연구원 분담표 ... 70
• 제10장 참고문헌 ... 72
• 제11장 첨부서류 ... 72
• 끝페이지 ... 73