초록 ▼

연구개발목표 및 내용
최종 목표
기능성 성분 고함유 콩 유용 자원 개발 및 이용성 증진
전체 내용
1) 콩 기능성 성분 고햠량 연관 마커 개발
2) 기능성 성분 고함유 우량 콩 계통 육성
3) 기능성 성분 고함유 콩을 이용한 건강기능성식품 시제품 개발 방법 수립

연구개발성과
1) 진풍(육성품종) x IT109098(재래콩) 교배집단에서 고밀도 유전자 지도 작성
- 모부본 진풍과 IT109098에 대한 resequencing와 RIL들의 genotyping-by-sequencin

연구개발목표 및 내용
최종 목표
기능성 성분 고함유 콩 유용 자원 개발 및 이용성 증진
전체 내용
1) 콩 기능성 성분 고햠량 연관 마커 개발
2) 기능성 성분 고함유 우량 콩 계통 육성
3) 기능성 성분 고함유 콩을 이용한 건강기능성식품 시제품 개발 방법 수립

연구개발성과
1) 진풍(육성품종) x IT109098(재래콩) 교배집단에서 고밀도 유전자 지도 작성
- 모부본 진풍과 IT109098에 대한 resequencing와 RIL들의 genotyping-by-sequencing을 통해 soybean reference genome sequence와 비교하여 동정한 4,066개 SNP 마커를 이용하여 유전자연관지도를 작성하였음.
- 진풍xIT109098 RIL 집단의 유전자연관지도는 20개의 염색체와 총 4,351cM 길이로 이루어졌으며, 염색체당 평균 마커 수는 203.3개이고 인접 마커간 평균 거리는 1.1cM, 염색체 평균거리는 217.6cM임.
2) 기능성 성분 고함유 연관 QTL 동정
○ 진풍 x IT109098 RIL 집단에서 기능성 성분 에피카테친 함량과 배꼽색 표현형 조사
- 진풍은 노란색 종피를 가진 반면 IT109098은 녹갈색 종피를 나타냄. HPLC 분석으로 진풍은 에피카테친이 측정되지 않았지만 IT109098은 2020년 에피카테친 함량이 1538.9 ± 78.5 μ g/g)이고 2021년 에피카테친 함량은 834.3 ± 285.5 μg/g이었음. RIL들에서 평균 에피카테친 함량은 2020년에 175.5 ± 441.8 μg/g (range: 0.00 ± 0.00 to 1965.33 μg/g), 2021년에 61.7 ± 181.0 μg/g (range: 0.00 ± 0.00 to 906.36 μg/g)이었음. 두 해 모두 에피카테친 함량의 유전력은 높게 나타남(2020: H² = 0.9763; 2021: H² = 0.9974).
- 진풍 x IT109098 RIL 집단에서 배꼽색의 다양한 변이가 관찰되었고 배꼽색을 0에서 4까지 등급으로 조사했을 때 RIL들의 배꼽색 평균 점수는 2020년에 2.3 ± 1.2이고 2021년에 2.7 ± 1.1이었음. RIL 집단의 교배 모부본은 에피카테친 함량과 배꼽색에서 유의미한 차이를 나타내었고 이들 후대에서 두 형질은 bimodal distribution을 보였음. 연속 2개년동안 측정한 에피카테친 함량과 배꼽색은 높은 정의 상관관계를 보였음.
○ 에피카테친 함량과 배꼽색 연관 QTL 동정
- LOD threshold 3.37을 초과하는 에피카테친 함량과 배꼽색 연관 QTL은 총 5개가 동정되었음. 에피카테친 함량 연관 QTL은 2개로서, 염색체 6번과 8번에 위치해 있기 때문에 각각 qEC06과 qEC08로 명명하였음. qEC06은 두 개의 마커, Chr06_18555043과 Chr06_18864382 사이에 있고, 10.50%의 percentage variance explained (PVE)값을 가지고 LOD score는 8.63이었음. qEC08의 양 쪽 측면 마커는 Chr08_8771172와 Chr08_921478이며, 12.24의 LOD score와 15.16%의 PVE값을 나타내었음. qEC06와 qEC08 모두 negative allelic additive effects을 보였는데 이것은 화분친 IT109098에서 beneficial allele이 유래되었음을 의미함
- 배꼽색 연관 QTL은 4개가 동정되었음. 6번 염색체에 위치한 두 개의 QTL은 qHilum6-1과 qHilum6-2로서, qHilum6-1은 13.96의 LOD score와 6.69%의 PVE값을 보였고, qHilum6-2의 LOD score와 PVE값은 각각 6.36과 2.80%이었음. 19번 염색체상에 존재하는 배꼽색 연관 QTL qHilum19-1은 11.82의 LOD score와 5.49%의 PVE값을 나타내었음. 에피카테친 함량을 조절하는 주동유전자 QTL인 qEC08은 배꼽색의 주동유전자로도 동일하게 동정되었으며, 높은 값의 LOD score(65.89)와 PVE값(58.59%)을 나타내었음.
3) allele stacking을 이용한 기능성성분 에피카테친 연관 QTL 확인
- qEC08의 물리적 위치로부터 200kb 이내에 I locus(Chr08_8,380,000에서 Chr08_8,520,000)가 위치하고 있는데 이것은 플라보노이드의 존재 유무를 결정하는 주된 스위치 역할을 하는 CHS gene cluster를 포함하고 있음. 따라서 본 연구에서 동정된 qEC08을 조절하는 것이 I locus인지를 조사할 필요성이 있음. 이들 두 유전자좌에서 모부본간 염기서열변이를 분석하여 qEC08과 I와의 관계 그리고 RIL 집단에서 I locus가 에피카테친 함량에 대해 영향을 미치는지 조사하였음
○ 진풍과 IT109098에서 I locus의 대립유전자 결정
- I locus는 종피의 표피층에서 안토시아닌과 프로안토시아니딘 축척을 결정함. 우성 대립인자 I와 3개의 열성 대립인자(우성 정도에 따라 iⁱ > i^k > i)가 색소의 공간적 분포를 조절함. 종피색이 배꼽에 국한되면 안장 모양으로 나타나거나 종피 전체가 착색되기도 함. 우성 대립인자들(I 또는 ii)의 promoter sequences에서 결실이 발생하면 CHS의 총 전사체 수준의 증가로 인해 착색된 종피가 됨. A. thaliana 염기서열과의 상동성을 토대로 I locus에는 총 9개의 CHS 유전자들이 있었음. 황색 종피에 진한 배꼽색을 가지는 진풍에서 CHS 유전자 염기서열(2 kb up과 downstream 포함)은 Williams 82 reference genome에서의 그것과 동일하고 이것은 iⁱ 우성 대립인자를 가지는 것을 의미함. IT109098과 reference genome을 비교해 보면 9개 CHS 유전자들의 coding sequence에서는 차이가 없었음. 그러나 서로 마주보는 방향성을 가지고 있는 CHS3a(Glyma.08G109300)와 CHS1(Glyma.08G109400)의 공통된 promoter 영역(~2 kb)에서 진풍과 다른 염기서열 변이를 나타내었음. CHS3a와 CHS1의 프로모터에서의 염기서열 차이로 인해 우성 ii와 열성 i 대립인자가 만들어진다고 추측함. 다시 말해서, 진풍의 CHS gene sequence가 reference genome에서의 그것과 동일하므로 진풍은 I locus에서 iⁱ allele를 포함하였음. 이에 반해 착색된 종피와 배꼽을 가진 IT109098은 CHS promoter sequences의 차이로 열성 i 대립인자를 가지고 있었음
○ RIL들에서 대립인자 조합별 에피카테친 함량 비교
- I locus가 에피카테친 함량과 배꼽색에 영향을 미치는지 알아보기 위해 RIL들이 I와 qEC08 유전자좌들에서 어떠한 대립인자를 가지고 있는지 조사하였음. I locus에서 진풍이나 IT109098과 동일한 대립인자를 가진 RIL들을 각각 iⁱ_Jinpung 또는 i_IT109098으로 명명하였음. 유사하게, qEC08에 대해서도 모부본으로부터 물려받은 대립인자에 따라 qEC08_Jinpung 또는 qEC08_IT109098로 RIL를 명명하였음. I locus의 대립인자에 상관없이, qEC08_IT109098 대립인자를 가진 후대계통들은 qEC08_Jinpung 대립인자를 가진 계통들보다 에피카테친 함량이 높았고, qEC08_Jinpung 대립인자를 가진 대부분의 RIL들은 에피카테친을 함유하지 않았음(0.00 μg/g). iⁱ_Jinpung와 i_IT109098 대립인자를 가진 계통들 간에 에피카테친 수준에 유의미한 차이는 없었음. 배꼽색에 대한 대립인자 조합별 영향에 대한 분석도 동일한 결과를 보였음. I locus에서 가진 대립인자에 상관없이 qEC08_IT109098 대립인자를 가진 계통들은 qEC08_Jinpung 대립인자를 가진 계통들보다 배꼽색 수치가 유의미하게 높았음. 이와 같은 결과를 볼 때 진풍 xIT109098 RIL 집단에서 I locus는 에피카테친과 배꼽색에 영향을 주지 않으며, 동정된 qEC08이 에피카테친과 배꼽색에 대한 주요한 QTL이라는 것을 확인할 수 있었음. 다시 말해, 두 유전자좌 I와 qEC08에서 대립인자 조합별 표현형의 영향에 대한 분석을 통해 본 RIL 집단에서 에피카테친 함유는 qEC08_IT109098 대립인자에 의해 결정됨을 알 수 있었음.
- qEC06 유전자좌를 포함한 3개의 유전자좌에서 각 대립인자 조합에 대한 allele stacking 분석을 수행하여 대립인자 조합별 후대계통들의 에피카테친 함량을 조사하였음. qEC06와 qEC08에서 둘 다 IT109098 대립인자를 가진 RIL들은 다른 대립인자 조합을 가진 계통들보다 에피카테친 함량이 높았고 I 대립인자의 차이는 에피카테친 함량에 유의미한 영향을 주지 않았음. 따라서 데이터의 복잡성을 줄이기 위해 이후의 분석에서는 I locus를 제거하였음. qEC06_IT109098와 qEC08_IT109098 대립인자를 가진 대부분의 RIL들은 높은 에피카테친 수준을 보였고(mean EC content: 429.79 μg/g; range: 0.00 to 1255.25 μg/g), HPLC로 정량할 수 없을 정도로 에피카테친을 함유하지 않은 다른 대립인자 조합을 가진 계통들(0.00 μg/g)과 유의미한 차이를 보였음.
4) 기능성 성분 에피카테친 함량 조절 후보유전자 동정
- 309kb 영역을 가지는 qEC06 유전자좌는 6번 염색체상에서 10개의 단백질 암호화 유전자를 포함하고 qEC08는 8번 염색체의 443kb을 차지하여 50개의 유전자를 포함하고 있음. 이들 모든 유전자의 예상된 기능은 A. thaliana ortholog를 사용하여 결정하였음. mapping parent 사이에서 coding region에서의 염기서열 변이를 동정하였음. qEC06는 FLAVONOID 3′-HYDROXYLASE (Glyma.06G202300)를 암호화하는 T Locus를 포함하고 있는데 이 유전자는 종피에서 cyanidin 기반 안토시아닌과 프로안토시아니딘 생합성뿐만 아니라 모용색(T:tawny; t: gray)과 관련되어 있음. 그러나 qEC08에는 에피카테친과 프로안토시아니딘 생합성과 관련된 애기장대 상동유전자들이 발견되지 않았음. 50개 유전자들 중 18개 유전자가 모부본간 염기서열 변이에 의해 단백질 서열에 차이를 보이는 것으로 예측되었음
- qEC08내 존재하는 유전자들 중에서 R5와 R7 시기에서 모부본간 발현의 차이를 보이는 유전자를 조사하기 위해 이전 연구에서 해당 시기에 IT109098과 황금의 종자에서 분석한 RNA-Seq 데이터를 분석하였음. 황금은 진풍과 같이 진한 배꼽에 황색 종피를 가지고 있고 에피카테친을 생성하지 않으며 I locus에서의 대립인자는 Williams 82 및 진풍과 동일함.
- IT109098과 황금의 종자 간에 발현 수준 차이의 배수가 Log₂(FC) ≤ -1 그리고 Log₂(FC) ≥ 1일 때, 차별적 발현 유전자로 정하였음. 50개의 단백질 암호화 유전자들 중에서 7개 유전자들(Glyma.08G114900, Glyma.08G115100, Glyma.08G115600, Glyma.08G115800, Glyma.08G116300, Glyma.08G118400, 그리고 Glyma.08G119300)이 두 생육 단계에 걸쳐 높은 발현을 보였음. 5개의 다른 유전자들(Glyma.08G115200, Glyma.08G116000, Glyma.08G116500, Glyma.08G117600, 그리고 Glyma.08G119100)은 중간 수준의 발현을 보였으며, 3개의 유전자들(Glyma.08G116800, Glyma.08G116900, 그리고 Glyma.08G117500)은 모부본 모두에서 R5 시기에서만 발현하였음.
- R5 단계에서 4개의 유전자들(Glyma.08G114800, Glyma.08G116900, Glyma.08G118000, 그리고 Glyma.08G118100)은 upregulation 하였고, 3개의 다른 유전자들(Glyma.08G114900, Glyma.08G116000, 그리고 Glyma.08G117000)은 upregulation하였음. R7 단계에서 5개의 유전자들(Glyma.08G117200, Glyma.08G118200, Glyma.08G118400, Glyma.08G118700, 그리고 Glyma.08G118900)이 upregulation하였고, 다른 8개의 유전자들(Glyma.08G115100, Glyma.08G115600, Glyma.08G116300, Glyma.08G116800, Glyma.08G117000, Glyma.08G117300, Glyma.08G118100, 그리고 Glyma.08G118800)은 downregulation하였음.
- R5 단계보다 R7 단계에서 모부본간 발현 차이를 보이는 유전자들이 더 많았음. R5와 R7 시기의 종자에서 차별적으로 발현하는 20개 유전자들 중에서 6개 유전자들(Glyma.08G114800, Glyma.08G114900, Glyma.08G116000, Glyma.08G116800, Glyma.08G116900, 그리고 Glyma.08G117000)은 코딩 영역에서 모부본간 염기서열 변이도 가지고 있어 아미노산 서열도 달라짐.
5) 기능성성분 고함유 콩을 이용한 건강기능성 시제품 개발
○ 콩 추출물 제조법 수립
- 식물재료는 이소플라본 함량이 놓은 콩 품종인 늘품을 사용하였음
- 1단계 대두 불리기: 대두 50g을 증류수 450g에 넣어 4~5시간 동안 불림(대두 10%)
- 2단계 전처리: 블랜더를 이용해 불린 대두의 물을 같이 곱게 갈아낸 후 면보 또는 거름망을 이용해 걸러냄(추출수율 80%, 고형분 함량 7%).
- 3단계 포도당 첨가: 걸러낸 대두추출물에 포도당을 4% 첨가함.
- 4단계 살균: 110℃, 30분 처리
- 5단계 quality check로 일반 세균 및 유산균 검출이 안되도록 함
○ 유산균을 이용한 이소플라본 비배당체 함량이 높은 분말 제조법 수립
- 1단계 여과: 대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과액을 수득함
- 2단계 배양: 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양함
- 3단계 회수: 배양액을 24시간 침전을 유도하여 침전물을 회수함
- 4단계 흡착: 침전물을 수지를 이용하여 흡착함
- 5단계 분리: 흡착된 물질을 물로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리함

연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
○ 연구개발성과 활용계획
- 중요 농업형질에 대한 후속 연구 진행: 진풍 x IT109098 RIL 집단과 유전자지도는 초형, 종자크기, 종피색, 종피색과 종피무늬 등의 유전연구 및 마커개발에 활용하여 연구논문 확대 생산 가능
- 기능성 성분 조절 유전자 분리: 기능성성분 유용 유전자 선도적 확보 및 특허 출원 가능
- 고기능성 콩 품종 출원: 육성한 에피카테친 고함유 우량 계통의 생산력 및 지역적응성 검정을 통해 품종출원 가능
- 분자육종시스템 구축 기반 확립: 기능성성분 고함유 연관 분자마커 DNA칩 개발로 육종가 친화적 활용도 증대
- 개발된 콩 건강기능식품 시제품의 산업화 가능
○ 기대효과
- 기능성성분 고함유 마커 개발 기술 축적 및 고도화
- 기능성 콩 자원 확보 및 기능성 강화 프리미엄 종자 개발로 미래 농업 발전상 제시
- 기능성성분 콩 개발과 이용성 증진 추진체계 모델 제시로 소비자 맞춤형 콩 개발 시스템에 응용 가능
- 종자산업 강화 및 미래 농업 신성장 동력 제공
- 기능성 콩 천연재료 이용을 통한 고부가가치 건강기능식품 산업 및 이미용 산업의 신수요 신시장 창출
- 기능성 콩 재배 농가의 소득 증대 및 고부가가치 상품 개발로 지역 농업사회 발전

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요 약 문 ... 2
• 목차 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행내용 ... 7
• 가) 진풍 x IT109098 RIL 집단에 대한 고밀도 유전자연관 지도 작성 ... 7
• 나) 종자 에피카테친 정량 및 배꼽색 조사 ... 9
• 다) QTL 대립인자 조합별 표현형 변이 비교 ... 9
• 라) QTL 영역에서 후보 유전자 탐색을 위한 염기서열 변이와 발현 차이 조사 ... 9
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 10
• 1) 연구 수행 결과 ... 10
• 2) 목표 달성 수준 ... 29
• 4. 목표 미달 시 원인분석 ... 29
• 5. 연구개발성과 및 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 30
• 6. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 30
• 끝페이지 ... 31