초록 ▼

진핵생물의 mRNA 는 N7-methylguanosine 이 전사체의 5‘ 말단에 triphosphate 결합으로 연결된 Cap0 의 형태를 나타내고 있음. 인간과 같은 고등생물종의 mRNA 는 첫번째 뉴클레오타이드의 2’-O 위치에 추가적인 methylation 이 일어난 형태인 Cap1 구조를 보이는데 이는 mRNA 의 반감기를 매우 증가시킨다고 알려져 있음. 따라서 진핵 생물을 감염시키는 바이러스에서 유래한 capping enzyme 들이 최근 들어 mRNA 백신산업계에서 mRNA를 합성하기 위해 필요한 주요 원부자재로 인식되

진핵생물의 mRNA 는 N7-methylguanosine 이 전사체의 5‘ 말단에 triphosphate 결합으로 연결된 Cap0 의 형태를 나타내고 있음. 인간과 같은 고등생물종의 mRNA 는 첫번째 뉴클레오타이드의 2’-O 위치에 추가적인 methylation 이 일어난 형태인 Cap1 구조를 보이는데 이는 mRNA 의 반감기를 매우 증가시킨다고 알려져 있음. 따라서 진핵 생물을 감염시키는 바이러스에서 유래한 capping enzyme 들이 최근 들어 mRNA 백신산업계에서 mRNA를 합성하기 위해 필요한 주요 원부자재로 인식되고 있음.

Vaccinia virus 의 D1 (844-aa)-D12 (287-aa) 복합체는 Cap0 구조 형성에 필요한 triphosphatase, RNA guanylyl transferase 와 guanine N-7 methyl transferase 활성을 보유하고 있으며 VP39 (333-aa) 단백질은 Cap1 구조 형성에 필수적인 2’-O methyltransferase을 나타냄. 본 개발 과제에서 연구진은 Vaccinia virus 유래 D1-D12 복합체 및 VP39 단백질의 유전자를 클로닝하여 발현한 후 순수 분리 정제하는데 성공하였음. 다단계 크로마토그래피 과정을 통해 정제된 단백질은 non-specific exo-/endonuclease 가 없음을 확인하였으며 endotoxin level 이 0.1 EU/ug 이하로 매우 깨끗함을 알 수 있었음. 추가적으로 [α-³²P]-GTP 와 [³H-CH₃] AdoMet 과 같은 다양한 방사성 동위원소를 기질로 사용하여 정제된 효소의 생화학적 활성이 있음을 검증하였음. 최종적으로, luciferase 유전자를 코딩하고 있는 mRNA를 개발된 Capping enzyme을 이용하여 Capping 한 후 인간 HeLa 세포에 도입하였을 때 Cap analog 또는 외산 경쟁 효소 제품을 이용하였을 때 보다 동등 또는 이상의 luciferase 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었음.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

Eukaryotic mRNA has Cap0 structure consisting of N7-methylguanosine linked via a triphosphate bridge to the 5’ end of the transcript. In higher eukaryotes, mRNA is further modified by a methylation of the ribose 2’-O position of the first transcribed nucleotide and the modified structure is referred

Eukaryotic mRNA has Cap0 structure consisting of N7-methylguanosine linked via a triphosphate bridge to the 5’ end of the transcript. In higher eukaryotes, mRNA is further modified by a methylation of the ribose 2’-O position of the first transcribed nucleotide and the modified structure is referred to as a Cap1, which is essential for increasing half-life of the mRNA. In the mRNA vaccine industry, capping enzymes from eukaryotic viruses, which makes the Cap structure, is are considered as a major raw materials for mRNA synthesis.

Vaccinia virus D1 (844-aa)-D12 (287-aa) heterodimer has the triphosphatase, RNA guanylyl transferase and guanine N-7 methyl transferase activities required for the Cap0 structure formation and VP39 (333-aa) contains the 2’-O methyltransferase activity which is essential for the preparation of Cap1-structured mRNA. In this project, we successfully cloned, expressed, and purified a vaccinia virus D1-D12 complex and VP39 proteins. Through multiple chromatographic steps, we obtained highly clean proteins devoid of non-specific exo/endonuclease activities and the endotoxin level was measured below 0.1 EU/μg. We also confirmed the biochemical activities of capping enzymes with radioactive substrates, [α-³²P]-GTP and [³H-CH₃] AdoMet. The mRNA encoding luciferase gene capped by these vaccinia enzymes demonstrated comparable or even greater luciferase activity to the one capped by enzymes of global supplier or the mRNA with Cap analog.

(source : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 4
• Summary ... 5
• 학술연구개발용역과제 연구결과 ... 6
• 제1장 최종 목표 ... 6
• 제2장 국내외 기술 현황 ... 31
• 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 41
• 제4장 최종 연구 결과 ... 101
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 101
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 104
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 107
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 107
• 제9장 연구비 사용 내역 및 연구원 분담표 ... 108
• 제10장 참고문헌 ... 110
• 제11장 첨부서류 ... 111
• 끝페이지 ... 119