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문제 정의
- 본 연구에서는 ICH 가이드라인에 따라 HPLC-UV를 이용하여 마황의 (+)-pseudoephdrine과 (-)-ephedrine의 동시분석법을 개발하고 이에 대한 검증을 하였다. 본 연구의 분석법과 검증에 근거하여 마황 및 마황을 함유한 제제의 정확한 분석 및 정량분석에 대한 연구에 기초연구자료로 활용될 수 있으며 또한 마황의 품질 검증에 연구자료로 사용 될 수 있을 것이라 사료된다.
- 본 연구에서는 마황의 (+)-pseudoephedrine(1)과 (-)-ephedrine(2)은 부분입체이성질체로서 HPLC-UV를 이용한 동시분석법 개발을 하고자 하였다.
제안 방법
- HPLC 이동상으로 A(25mM SDS)와 B(아세토니트릴)을 이용하여 A:B(60:40) 비율로 40분간 유속 1 mL/ min으로 실험을 진행하였다. 컬럼의 온도는 35 ℃로 설정하였고 자외선 검출파장은 215 nm를 설정하였으며 주입용량은 10 μl으로 설정하였다.
- ICH guide line에 따라 LOD = 3.3×(∂/S), LOQ = 10×(∂/S) 계산식을 이용하여 계산하였다.
- PDA 검출기를 이용하여 마황의 지표물질의 자외선 흡수 스펙트럼을 측정하고 마황 시료의 크로마토그램 내에서 지표물질 피크의 자외선 흡수 스펙트 럼을 측정하여 각 스펙트럼을 비교하여 지표물질의 특이성을 판단하였다.
- 마황 2 g에 70% EtOH을 10 mL을 넣어 65℃에 4시간 동안 중탕 추출한 뒤 추출물을 여과하여 농축 한 후 완전히 동결건조하여 가루 상태로 만든 뒤, 그 가루를 10 mg을 70% MeOH을 1 mL 넣어 녹인 후 0.45 μm 시린지 필터로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 하였다.
- 마황 시료에서 나타내는 지표물 질의 피크와 화합물 1과 2의 피크에 대한 자외선 흡수 스펙트럼을 측정하였다(Fig. 3). 그에 대한 결과 화합물 1과 2 의 흡수 스펙트럼과 같은 위치에 나타난 마황의 지표물질의 흡수 스펙트럼이 동일한 것을 확인하여 높은 특이성을 확인하였다.
- 마황의 지표물질를 3가지 농도로 제조한 후 시료에 첨가하여 일내에 3회 반복 측정하여 나온 면적값의 상대표준편차값을 구하여 일내 정밀성(intraday precision)을 측정하였고, 마황 시료를 하루에 1회 3일 간격으로 3회 반복 측정하여 나온 값의 상대표준편차를 구하여 일간 정밀성(interday precision) 을 측정하였다. 정확성은 마황 시료에 각 지표물질을 3개의 농도를 선택하여 첨가하여 검량선을 근거로 피크의 면적값을 계산하고 이를 3회 반복 측정하여 피크의 면적값을 구하여 원래의 농도로 환산하여 시료의 회수율을 구하고 그에 대한 상대표준편차값(RSD)을 구하여 측정하였다.
- 2,3) 따라서 마황이나 마황을 함유한 소재 내에서 에페드라 알칼로이드 함량을 평가하기 위한 분석법의 개발이 중요하다. 본 실험에 서는 기존의 마황 내 에페드라 알칼로이드 분석법을 응용하여, HPLC-UV를 이용한 마황의 지표물질인 (-)-ephedrine(1) 과 (+)-pseudoephedrine(2)의 동시분석법을 개발하고 개발한 분석법에 대한 검증을 수행하였다.
- 1). 용매 내 에페드라 알칼로이드의 양성 이온화되는 성질을 차단하여 컬럼 내두 물질 간의 분리도를 높이고자 25 mM SDS를 버퍼로 하였다. 이는 SDS가 화합물 1과 2의 음성전위를 중성화 (neutralization)하여 C18 column 내에서 원활하게 분리가 되도록 하는 성질을 이용한 것이다.
- 이동상으로 25 mM SDS water와 acetonitrile을 등용매용리(isocratic) 조건으로 40분간 실험을 진행하여 화합물 1과 2를 확인하였다. 화합물 1이 28.
- 마황의 지표물질를 3가지 농도로 제조한 후 시료에 첨가하여 일내에 3회 반복 측정하여 나온 면적값의 상대표준편차값을 구하여 일내 정밀성(intraday precision)을 측정하였고, 마황 시료를 하루에 1회 3일 간격으로 3회 반복 측정하여 나온 값의 상대표준편차를 구하여 일간 정밀성(interday precision) 을 측정하였다. 정확성은 마황 시료에 각 지표물질을 3개의 농도를 선택하여 첨가하여 검량선을 근거로 피크의 면적값을 계산하고 이를 3회 반복 측정하여 피크의 면적값을 구하여 원래의 농도로 환산하여 시료의 회수율을 구하고 그에 대한 상대표준편차값(RSD)을 구하여 측정하였다.
- 화합물 1과 2을 100% MeOH에 1000 μg/ml 농도로 녹여 200, 100, 50, 20 μg/ml의 농도로 희석하여 5개의 농도로 검량선을 작성하였고 이에 대한 상관계수(R2)를 통하여 직선성을 측정하였다.
대상 데이터
- HPLC system은 Agilent 1260 series(Agilent, Santa, CA, USA)를 사용하였으며 UV detector는 Agilent 1260 MWD를 사용하였고, 분석용 컬럼은 HECTOR C18-M51002546 4.5 μm(4.6×250 mm)을 사용하였다.
- HPLC 분석에 사용된 용매와 시약은 HPLC용 물, acetonitrile, methanol(TEDIA, Fairfield, OH, USA)와 SDS(Bio-Rad, Hercules, California, USA)을 사용 하였다. 추출에 사용된 용매로는 2차 증류수와 시약용 용매 (대정화금㈜, 시흥, 경기도, 한국)을 사용하였다.
- 본 실험에서 ‘㈜화림제약’에서 구입한 파키스탄산 중마황(E. intermedia)의 마른 줄기를 사용하였고, 이는 동의대학교 신순식 교수로부터 감별 후 3 kg을 제공 받았다.
- HPLC 분석에 사용된 용매와 시약은 HPLC용 물, acetonitrile, methanol(TEDIA, Fairfield, OH, USA)와 SDS(Bio-Rad, Hercules, California, USA)을 사용 하였다. 추출에 사용된 용매로는 2차 증류수와 시약용 용매 (대정화금㈜, 시흥, 경기도, 한국)을 사용하였다. 화합물 1과 2는 서울대학교 약학대학의 성상현교수 연구실로부터 제공받았다.
- 컬럼의 온도는 35 ℃로 설정하였고 자외선 검출파장은 215 nm를 설정하였으며 주입용량은 10 μl으로 설정하였다.
데이터처리
- 분석법에 대한 검증으로 직선성, 검출한계와 정량한계, 정확성, 정밀성, 특이성을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다.
성능/효과
- 검량선의 직선 방정식의 y절편 값의 표준편차와 직선 방정식의 기울기를 이용하여 ICH guide line에 따라 계산한 결과, 화합물 1의 검출한계는 0.0015 μg을 나타내었고 정량한계는 0.0044 μg을 나타내었으며 화합물 2의 검출한계는 0.0021 μg을 나타내었고 정량 한계는 0.0063 μg을 나타내어 미량의 성분까지 검출 및 정량이 가능함을 검증하였다(Table I).
- 3). 그에 대한 결과 화합물 1과 2 의 흡수 스펙트럼과 같은 위치에 나타난 마황의 지표물질의 흡수 스펙트럼이 동일한 것을 확인하여 높은 특이성을 확인하였다.
- 605%이하를 나타내었다(Table 2). 분석법의 정확성은 화합물 1의 3 가지 농도에서 회수율의 RSD 값은 0.153, 0.561, 0.974%였으며 화합물 2의 회수율의 RSD값은 0.646, 2.676, 0.974%로 3% 이하의 준수한 RSD값을 나타내었다(Table II).
- 표준물질을 100% MeOH에 1000 μg/ ml 농도로 녹여 200, 100, 50, 20 μg/ml의 농도로 희석하여 5개의 농도를 선택하여 검량선을 작성한 결과, 상관계수(R2)가 화합물 1은 1.0000을 나타내었고 화합물 2은 0.9997을 나타내어 높은 직선성을 나타냄을 확인하였다.
- 화합물 1과 2의 일내 정밀성(intraday precision)과 일간 정밀성(interday precision)를 측정한 결과, 모두 4.605%이하를 나타내었다(Table 2). 분석법의 정확성은 화합물 1의 3 가지 농도에서 회수율의 RSD 값은 0.
후속연구
- 본 연구에서는 ICH 가이드라인에 따라 HPLC-UV를 이용하여 마황의 (+)-pseudoephdrine과 (-)-ephedrine의 동시분석법을 개발하고 이에 대한 검증을 하였다. 본 연구의 분석법과 검증에 근거하여 마황 및 마황을 함유한 제제의 정확한 분석 및 정량분석에 대한 연구에 기초연구자료로 활용될 수 있으며 또한 마황의 품질 검증에 연구자료로 사용 될 수 있을 것이라 사료된다.
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