김치에서 분리한 Lactococcus lactis subsp. lactis A164의 nisin Z 생산 및 human β-defensin-1의 발현 Production of a bacteriocin, nisin Z by Lactococcus lactis subsp. lactis A164 isolated from kimchi and heterologous gene expression of human β-defensin-1원문보기
김치로부터 박테리오신을 생산하는 젖산균을 탐색하여 LAB-A164를 분리하였고, 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성 및 wh ole-cell p rotein 형식의 분석을 통하여Lactococcus lactis su bsp . lactis A164라 동정하였다. L. lactis A164가 생산하 박테리오신은 식품 유래 병원성균을 포함하는 ...
김치로부터 박테리오신을 생산하는 젖산균을 탐색하여 LAB-A164를 분리하였고, 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성 및 wh ole-cell p rotein 형식의 분석을 통하여Lactococcus lactis su bsp . lactis A164라 동정하였다. L. lactis A164가 생산하 박테리오신은 식품 유래 병원성균을 포함하는 그람양성균에 대하여 광범위한 항균활성을 나타냈으며, 몇몇 그람음성균에 대하여도 항균활성을 나타냈다. 본 박테리오 신의 활성은 pH 2.0에서 10.0까지 광범위하게 나타났으며, 특히 중성부근에서 가장 높게 나타났고, 단백질 가수분해 효소인 α, β-ch ymotryp sin과 p ron ase E를 처리할 경우 활성이 모두 소실되었으나, p ep sin, tryp sin 및 α-amylase를 처리할경우 활성이 소실되지 않았으며, 산성조건에서 열에 매우 안정한 특성을 나타냈다. 박테리오신 최대 생산은 M17 배지의 초기 pH를 7.0으로 하여 30℃에서 20시간 정치배양하였을 경우 가장 높은 생산량을 나타내어 이를 유안침전,SP-Sep h arose column chromatograp h y 및 u ltr afiltr ation으로 순수 정제하여Tricine-SDS-PAGE로 분자량을 산출한 결과 약 3.5-5.0 kDa으로 나타났으며, nisinA와 같은 분자량을 나타냈다. 본 박테리오신 유전자 clu ster를 클로닝하고 또한nested PCR을 이용하여 염기서열을 결정한 결과 n isin Z 유전자 clu ster와 99.8%의 상동성을 나타내어 L. lactis A164는 n isin Z 생산균주임 확인하였다. 그람음성균에 강한 항균 활성을 나타내는 human β-defen sin -1(hBD-1)을 L.lactis A164에서 발현하고자 hBD-1의 유전자를 PCR로 증폭하고 nisZ 의 p romoter와 leader sequ en ce를 융합시켜 이를 pGKV210에 클로닝하여 pGLZh 1-1을 제조하였다. L. lactis A164를 pGLZh 1-1로 형질전환하였을 때 L. lactis A164는 hBD-1의 항균활성에 의하여 생육할 수 없었기 때문에 항균활성을 불활성화 시키는 유전자 융합 방법을 고안하였다. pET-40b (+)의 fu sion-tag를 hBD-1 유전자에 융합시켜 이를 pOri23에 클로닝하고 pOED1을 제조하였다. 이를 L. lactis A164에 형질전환하여 배양하였을 때 L. lactis A164의 세포 내부에서 35.6 kDa의 hBD-1 융합단백질이 발현되었으며, 이는 숙주세포의 생육에 약간의 항균활성을 나타냈다. 또한hBD-1 융합단백질은 E. coli JM 109의 생육을 약 2 log 저해하였다. hBD-1 융합단백질을 Ni+ 친화성 크로마토그래피로 정제하고 en terokin ase로 fu sion-tag를 제거하여 matu re hBD-1을 분리하였으며, 이는 E. coli JM 109의 생육을 약 4 log 저해하는 것으로 보아, L. lactis A164/ pOED1은 생물학적으로 활성이 있는 hBD-1을 발현하였다.
김치로부터 박테리오신을 생산하는 젖산균을 탐색하여 LAB-A164를 분리하였고, 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성 및 wh ole-cell p rotein 형식의 분석을 통하여Lactococcus lactis su bsp . lactis A164라 동정하였다. L. lactis A164가 생산하 박테리오신은 식품 유래 병원성균을 포함하는 그람양성균에 대하여 광범위한 항균활성을 나타냈으며, 몇몇 그람음성균에 대하여도 항균활성을 나타냈다. 본 박테리오 신의 활성은 pH 2.0에서 10.0까지 광범위하게 나타났으며, 특히 중성부근에서 가장 높게 나타났고, 단백질 가수분해 효소인 α, β-ch ymotryp sin과 p ron ase E를 처리할 경우 활성이 모두 소실되었으나, p ep sin, tryp sin 및 α-amylase를 처리할경우 활성이 소실되지 않았으며, 산성조건에서 열에 매우 안정한 특성을 나타냈다. 박테리오신 최대 생산은 M17 배지의 초기 pH를 7.0으로 하여 30℃에서 20시간 정치배양하였을 경우 가장 높은 생산량을 나타내어 이를 유안침전,SP-Sep h arose column chromatograp h y 및 u ltr afiltr ation으로 순수 정제하여Tricine-SDS-PAGE로 분자량을 산출한 결과 약 3.5-5.0 kDa으로 나타났으며, nisinA와 같은 분자량을 나타냈다. 본 박테리오신 유전자 clu ster를 클로닝하고 또한nested PCR을 이용하여 염기서열을 결정한 결과 n isin Z 유전자 clu ster와 99.8%의 상동성을 나타내어 L. lactis A164는 n isin Z 생산균주임 확인하였다. 그람음성균에 강한 항균 활성을 나타내는 human β-defen sin -1(hBD-1)을 L.lactis A164에서 발현하고자 hBD-1의 유전자를 PCR로 증폭하고 nisZ 의 p romoter와 leader sequ en ce를 융합시켜 이를 pGKV210에 클로닝하여 pGLZh 1-1을 제조하였다. L. lactis A164를 pGLZh 1-1로 형질전환하였을 때 L. lactis A164는 hBD-1의 항균활성에 의하여 생육할 수 없었기 때문에 항균활성을 불활성화 시키는 유전자 융합 방법을 고안하였다. pET-40b (+)의 fu sion-tag를 hBD-1 유전자에 융합시켜 이를 pOri23에 클로닝하고 pOED1을 제조하였다. 이를 L. lactis A164에 형질전환하여 배양하였을 때 L. lactis A164의 세포 내부에서 35.6 kDa의 hBD-1 융합단백질이 발현되었으며, 이는 숙주세포의 생육에 약간의 항균활성을 나타냈다. 또한hBD-1 융합단백질은 E. coli JM 109의 생육을 약 2 log 저해하였다. hBD-1 융합단백질을 Ni+ 친화성 크로마토그래피로 정제하고 en terokin ase로 fu sion-tag를 제거하여 matu re hBD-1을 분리하였으며, 이는 E. coli JM 109의 생육을 약 4 log 저해하는 것으로 보아, L. lactis A164/ pOED1은 생물학적으로 활성이 있는 hBD-1을 발현하였다.
Lactococcus lactis subsp. lactis A164 was isolated from kimchi. The bacteriocin produced by strain A164 was active against closely related lactic acid bacteria and some food-borne pathogens including Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium. The antimicrobial spectrum...
Lactococcus lactis subsp. lactis A164 was isolated from kimchi. The bacteriocin produced by strain A164 was active against closely related lactic acid bacteria and some food-borne pathogens including Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium. The antimicrobial spectrum was nearly identical to that of nisin. Bacteriocin activity was not destroyed by exposure to elevated temperatires at low pH values, but the activity was lost at high pH values. This bacteriocin was inactivated by pronase E and α, β -chymotrypsin, but not by trypsin, pepsin, and α-amylase. The optimum conditions for the production of bacteriocin were at 30℃ for 20 h in M17 broth (pH 7.0). It was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation, sequential ion exchange chromatography, and ultrafiltration. Tricin-SDS-PAGE of purified bacteriocin gave the same molecular weight of 3.5 kDa as that of nisin. The gene encoding this bacteriocin was cloned and sequenced. It showed identical sequences to the nisin Z gene cluster (99.8% homology). These results indicate that bacteriocin produced by L. lactis A164 is nisin Z. The gene encoding hBD-1 was amp lified, fused to nisZ p romoter and leader sequence, and cloned into pGKV210(pGLZh 1-1). When L. lactis A164 was transformed by pGLZh 1-1, cell growth was not observed since the expressed hBD-1 showed antimicrobial activity. Therefore, the gene fusion system for the inactivation of antimicrobial activity was designed. hBD-1 gene was fused to the fusion-tag part of pET-40b(+), cloned into pOri23 and made a resulting plasmid, pOED1. L. lactis A164 carrying pOED1 produced an intracellular 35.6 kDa hBD-1 fusion protein. It showed slight an timicrobial activity against host cells. To obtain mature hBD-1, hBD-1 fusion protein was purified by nickel affinity column chromatography and cleaved withen terokinase. Mature hBD-1 showed strong antimicrobial activity against E. coli JM 109. These results reveal that L. lactis A164 produces a biologically active hBD-1.
Lactococcus lactis subsp. lactis A164 was isolated from kimchi. The bacteriocin produced by strain A164 was active against closely related lactic acid bacteria and some food-borne pathogens including Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium. The antimicrobial spectrum was nearly identical to that of nisin. Bacteriocin activity was not destroyed by exposure to elevated temperatires at low pH values, but the activity was lost at high pH values. This bacteriocin was inactivated by pronase E and α, β -chymotrypsin, but not by trypsin, pepsin, and α-amylase. The optimum conditions for the production of bacteriocin were at 30℃ for 20 h in M17 broth (pH 7.0). It was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation, sequential ion exchange chromatography, and ultrafiltration. Tricin-SDS-PAGE of purified bacteriocin gave the same molecular weight of 3.5 kDa as that of nisin. The gene encoding this bacteriocin was cloned and sequenced. It showed identical sequences to the nisin Z gene cluster (99.8% homology). These results indicate that bacteriocin produced by L. lactis A164 is nisin Z. The gene encoding hBD-1 was amp lified, fused to nisZ p romoter and leader sequence, and cloned into pGKV210(pGLZh 1-1). When L. lactis A164 was transformed by pGLZh 1-1, cell growth was not observed since the expressed hBD-1 showed antimicrobial activity. Therefore, the gene fusion system for the inactivation of antimicrobial activity was designed. hBD-1 gene was fused to the fusion-tag part of pET-40b(+), cloned into pOri23 and made a resulting plasmid, pOED1. L. lactis A164 carrying pOED1 produced an intracellular 35.6 kDa hBD-1 fusion protein. It showed slight an timicrobial activity against host cells. To obtain mature hBD-1, hBD-1 fusion protein was purified by nickel affinity column chromatography and cleaved withen terokinase. Mature hBD-1 showed strong antimicrobial activity against E. coli JM 109. These results reveal that L. lactis A164 produces a biologically active hBD-1.
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