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1.전사 종결 염기 서열이 외래 단백질 발현에 미치는 영향 Drosophila melanogaster Schneider line 2 (S2) 세포의 외래 단백질 발현 시스템을 이용한 외래 단백질의 한시적 발현을 검토하고, 서로 다른 terminator를 이용하였을 때의 단백질 발현 및 mRNA 발현 정도를 검토하였다. 한시적 발현의 경우 transfection agent를 제거하고 36 - 48 시간 동안 배양하였을 때 가장 높은 green fluorescent ...

1.전사 종결 염기 서열이 외래 단백질 발현에 미치는 영향 Drosophila melanogaster Schneider line 2 (S2) 세포의 외래 단백질 발현 시스템을 이용한 외래 단백질의 한시적 발현을 검토하고, 서로 다른 terminator를 이용하였을 때의 단백질 발현 및 mRNA 발현 정도를 검토하였다. 한시적 발현의 경우 transfection agent를 제거하고 36 - 48 시간 동안 배양하였을 때 가장 높은 green fluorescent protein (GFP)의 발현을 보였다. SV40 p(A), SV40 small T-antigen, 인간 gastrin 3′UTR을 terminator로 지니는 발현 벡터시스템에 각각 endostatin 유전자를 cloning 시킨 뒤 재조합 endostatin의 발현 및 mRNA의 발현 정도를 비교하였다. 한시적 발현을 시킨 뒤 36 시간 후 endostatin의 발현 정도를 비교해 본 결과 SV40 p(A)를 terminator로 사용했을 때 mRNA 및 단백질의 발현이 가장 높았다. 2.Ribonuclease/angiogenin Inhibitor (RAI) 발현 S2 세포 확립과 분리정제 본 연구에서는 lipofectin을 이용한 stable transfomation 방법을 사용하여 ribonuclease/angiogenin inhibitor (RAI) 유전자가 안정적으로 형질전환된 Drosophila melanogaster S2 세포를 확립하고 재조합 RAI의 분리 정제 및 효소 활성에 관한 연구를 수행하였다. Drosophila melanogaster S2 세포에 적용했을 때 외래 단백질 발현 효율이 가장 높았던 SV40 p(A)를 terminator로 지니는 pMT/BiP-V5-His 초파리 발현 벡터에 RAI의 cDNA를 클로닝 한 뒤 hygromycin B phosphotransferase 유전자를 selection marker로 지니는 pCoHYGRO와 함께 S2 세포에 co-transfection 시키고 선별과정을 거친 후 RAI 유전자가 안정적으로 형질전환된 S2 세포를 확립하였다. 형질전환된 S2 세포에서부터 약 50-kDa의 재조합 단백질 RAI가 발현되는 것을 Western blot 분석을 통해 확인하였다. 재조합 단백질 분리를 위해 Ni-NTA affinity chromatography를 수행하였으며 60 mM imidazole elution 분획에서 재조합 단백질 RAI가 모두 elution 됨을 확인하였다. Ni-NTA affinity chromatography 수행 후 재조합 단백질 RAI가 포함된 elution 분획을 다시 anion-exchange chromatography를 수행하여 단일 단백질 인 RAI를 분리 정제하였고 RNase activity를 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

1.Utilizing the foreign gene expression system of the Drosophila melanogaster Schneider line 2 (S2) cell, the degree of transient expression and mRNA expression was examined with differnt terminators. In the case of transient expression, the expression level of green fluorescent protein (GFP) was th...

1.Utilizing the foreign gene expression system of the Drosophila melanogaster Schneider line 2 (S2) cell, the degree of transient expression and mRNA expression was examined with differnt terminators. In the case of transient expression, the expression level of green fluorescent protein (GFP) was the highest when the transfection agent was eliminated and then cultivated for 36 to 48 hr. The terminators (SV40 p(A), SV40 small T-antigen and human gastrin 3′UTR) of the expression vector system were each cloned with endostatin; thereafter, the expression levels of the endostatin and its mRNA were compared. When the expression levels of endostatin were compared 36 hr after transfection, the SV40 p(A) terminator showed the highest expression level of endostatin and its mRNA. 2.Drosophila melanogaster S2 cells provide attractive feature for efficient expression of heterologous gene products. Recombinant plasmid harboring heterologous genes coding ribonuclease/angiogenin inhibitor (RAI) was transfected and expressed stably in Drosophila melanogaster S2 cells. Stably transformed polyclonal cell populations expressing RAI was isolated after 4 weeks of selection with hygromycin B. The recombinant RAI expressed in the stably transformed S2 cells was a molecular weight (MW) of 50 kDa, and was detected in the intracellular (cell) and extracellular (medium) fraction of transformed S2 cells. Recombinant RAI was purified from extracellular fraction using a two-step purification scheme comprised of Ni-NTA affinity and ion-exchange chromatography. The purified RAI migrated on SDS-PAGE as single band in elution fraction with 300 mM NaCl in 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) at ion-exchange chromatography. Thereafter the enzymatic activity of the recombinant RAI was measured.

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