[학위논문]밀리타리스동충하초 (cordyceps militaris) 열수추출물의 항암활성 및 면역조절 작용에 미치는 영향 Antitumor and immunomodulatory activities of cordyceps militaris water extracts원문보기
본 연구는 in vivo 실험을 통하여 누에번데기(silkworm pupa) 또는 누에애벌레(silkworm larva)를 기주로 인공재배된 밀리타리스동충하초를 대상으로 항암 및 면역조절 활성을 평가하고, in vitro 실험을 통하여 인체혈액암 세포주인 HL-60 세포를 대상으로 누에번데기를 기주로 한 밀리타리스동충하초가 caspase-3와 관련한 아폽토시스 작용기전을 경유하여 아폽토시스를 유도하는 지의 여부를 평가하고, ...
본 연구는 in vivo 실험을 통하여 누에번데기(silkworm pupa) 또는 누에애벌레(silkworm larva)를 기주로 인공재배된 밀리타리스동충하초를 대상으로 항암 및 면역조절 활성을 평가하고, in vitro 실험을 통하여 인체혈액암 세포주인 HL-60 세포를 대상으로 누에번데기를 기주로 한 밀리타리스동충하초가 caspase-3와 관련한 아폽토시스 작용기전을 경유하여 아폽토시스를 유도하는 지의 여부를 평가하고, cDNA microarray, RT-PCR 및 real-time PCR 분석을 통하여 유전자발현 여부를 규명하고자 시도되었다. 기주를 달리한 누에번데기(silkworm pupa) 및 누에애벌레(silkworm larva) 밀리타리스동충하초 (Cordyceps militaris) 열수추출물이 Sarcoma-180 세포로 유발한 ICR 마우스모델에서 복수암 및 고형암에 대한 항암 및 면역기능에 미치는 영향을 측정하였다. 동충하초추출물이 복강암이 유발된 마우스의 수명연장에 미치는 효과를 측정한 결과, 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg 농도의 누에번데기 및 누에애벌레 밀리타리스동충하초 추출물을 투여받은 군의 평균 생존일수는 대조군에 비해 유의하게 증가되었다(p<0.05). 동충하초추출물이 겨드랑이에 고형암이 유발된 마우스의 고형암 성장저지능, 면역관련 장기의 무게변화, 비장내 면역세포수의 변화, 그리고 비장세포에 의한 interleukin-2 (IL-2) 생성능을 측정한 결과, 밀리타리스동충하초군이 대조군에 비해 고형암 성장이 유의적으로 억제되었다(p<0.05). 또한 밀리타리스동충하초를 투여받은 마우스는 대조군에 비해 흉선무게가 38~44% 유의하게 증가하였고(p<0.05), 비장내 CD4+ 및 CD8+ T-세포수, NK-세포수(63~110% 증가), 그리고 비장세포에 의한 IL-2 생성능(33~51% 증가)이 모두 유의하게 증가하였다(p<0.05). 인체혈액암 세포주인 HL-60 세포주를 대상으로 누에번데기 밀리타리스동충하초(CM)가 caspase-3와 관련한 작용기전을 거쳐 apoptosis를 유도하는지 알아보고자 실험을 수행하였다. CM은 인체 혈액암세포의 증식을 억제하는 효과가 있었으며, CM의 IC_(50) 값은 0.8 mg/ml로 나타났다. 세포를 1 mg/ml CM으로 16시간동안 처리한 결과 전형적인 apoptosis 특이 형태가 관찰되었다. HL-60 세포주를 CM으로 24시간동안 처리한 결과, 농도 의존적으로 DNA 분절현상이 관찰되었다. 아울러 세포를 1 mg/ml CM으로 시간을 달리하여 처리한 결과 8시간 이후부터 DNA 분절현상이 나타났으며, 처리시간이 증가할수록 DNA 분절 정도가 심화되었다. CM에 의한 apoptosis 유도기전을 평가하기 위해 western blot을 통해 관련 단백질들의 발현을 평가한 결과, CM 처리 시 미토콘드리아내에 존재하던 cytochrome c가 세포질로 방출되고 불활성 형태의 caspase-3 및 poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP)가 활성화되었음이 관찰되었으나, Bcl-2 단백질의 발현에는 변화가 없는 것으로 나타났다. 누에번데기 밀리타리스동충하초를 인체혈액암세포주인 HL-60 세포주에 처리하였을 때 유전자의 발현변화를 알아보고자 cDNA microarray 분석 및 RT-PCR과 real-time PCR을 수행하였다. 1 mg/ml 누에번데기 밀리타리스동충하초를 HL-60 세포주에 16시간동안 전처리한 후 cDNA microarray를 시행한 후 항암과 면역과 관련되어 변화가 나타난 유전자를 분류하였고, 항암(TNF ligand, TNF receptor, p53,, p19, WT1, Myc) 및 면역(MHC II class transactivator, IL-12, integrin, cathepsin S)관련 유전자를 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 cDNA microarray에서 나타난 결과와 비교한 결과 세포주기를 조절하여 아폽토시스 유도를 촉진시키며, 면역증진 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서 밀리타리스동충하초 열수추출물은 항암활성 및 면역증진에 좋은 물질로 사려된다.
본 연구는 in vivo 실험을 통하여 누에번데기(silkworm pupa) 또는 누에애벌레(silkworm larva)를 기주로 인공재배된 밀리타리스동충하초를 대상으로 항암 및 면역조절 활성을 평가하고, in vitro 실험을 통하여 인체혈액암 세포주인 HL-60 세포를 대상으로 누에번데기를 기주로 한 밀리타리스동충하초가 caspase-3와 관련한 아폽토시스 작용기전을 경유하여 아폽토시스를 유도하는 지의 여부를 평가하고, cDNA microarray, RT-PCR 및 real-time PCR 분석을 통하여 유전자발현 여부를 규명하고자 시도되었다. 기주를 달리한 누에번데기(silkworm pupa) 및 누에애벌레(silkworm larva) 밀리타리스동충하초 (Cordyceps militaris) 열수추출물이 Sarcoma-180 세포로 유발한 ICR 마우스모델에서 복수암 및 고형암에 대한 항암 및 면역기능에 미치는 영향을 측정하였다. 동충하초추출물이 복강암이 유발된 마우스의 수명연장에 미치는 효과를 측정한 결과, 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg 농도의 누에번데기 및 누에애벌레 밀리타리스동충하초 추출물을 투여받은 군의 평균 생존일수는 대조군에 비해 유의하게 증가되었다(p<0.05). 동충하초추출물이 겨드랑이에 고형암이 유발된 마우스의 고형암 성장저지능, 면역관련 장기의 무게변화, 비장내 면역세포수의 변화, 그리고 비장세포에 의한 interleukin-2 (IL-2) 생성능을 측정한 결과, 밀리타리스동충하초군이 대조군에 비해 고형암 성장이 유의적으로 억제되었다(p<0.05). 또한 밀리타리스동충하초를 투여받은 마우스는 대조군에 비해 흉선무게가 38~44% 유의하게 증가하였고(p<0.05), 비장내 CD4+ 및 CD8+ T-세포수, NK-세포수(63~110% 증가), 그리고 비장세포에 의한 IL-2 생성능(33~51% 증가)이 모두 유의하게 증가하였다(p<0.05). 인체혈액암 세포주인 HL-60 세포주를 대상으로 누에번데기 밀리타리스동충하초(CM)가 caspase-3와 관련한 작용기전을 거쳐 apoptosis를 유도하는지 알아보고자 실험을 수행하였다. CM은 인체 혈액암세포의 증식을 억제하는 효과가 있었으며, CM의 IC_(50) 값은 0.8 mg/ml로 나타났다. 세포를 1 mg/ml CM으로 16시간동안 처리한 결과 전형적인 apoptosis 특이 형태가 관찰되었다. HL-60 세포주를 CM으로 24시간동안 처리한 결과, 농도 의존적으로 DNA 분절현상이 관찰되었다. 아울러 세포를 1 mg/ml CM으로 시간을 달리하여 처리한 결과 8시간 이후부터 DNA 분절현상이 나타났으며, 처리시간이 증가할수록 DNA 분절 정도가 심화되었다. CM에 의한 apoptosis 유도기전을 평가하기 위해 western blot을 통해 관련 단백질들의 발현을 평가한 결과, CM 처리 시 미토콘드리아내에 존재하던 cytochrome c가 세포질로 방출되고 불활성 형태의 caspase-3 및 poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP)가 활성화되었음이 관찰되었으나, Bcl-2 단백질의 발현에는 변화가 없는 것으로 나타났다. 누에번데기 밀리타리스동충하초를 인체혈액암세포주인 HL-60 세포주에 처리하였을 때 유전자의 발현변화를 알아보고자 cDNA microarray 분석 및 RT-PCR과 real-time PCR을 수행하였다. 1 mg/ml 누에번데기 밀리타리스동충하초를 HL-60 세포주에 16시간동안 전처리한 후 cDNA microarray를 시행한 후 항암과 면역과 관련되어 변화가 나타난 유전자를 분류하였고, 항암(TNF ligand, TNF receptor, p53,, p19, WT1, Myc) 및 면역(MHC II class transactivator, IL-12, integrin, cathepsin S)관련 유전자를 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 cDNA microarray에서 나타난 결과와 비교한 결과 세포주기를 조절하여 아폽토시스 유도를 촉진시키며, 면역증진 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서 밀리타리스동충하초 열수추출물은 항암활성 및 면역증진에 좋은 물질로 사려된다.
This study was undertaken to evaluate the mechanisms of Cordyceps militaris water extract on anticancer and apoptosis following in vivo and in vitro experimental tests. Hot water-extracts prepared from Cordyceps militaris of silkworm pupa (CMP) or Cordyceps militaris of silkworm larva (CML) were tes...
This study was undertaken to evaluate the mechanisms of Cordyceps militaris water extract on anticancer and apoptosis following in vivo and in vitro experimental tests. Hot water-extracts prepared from Cordyceps militaris of silkworm pupa (CMP) or Cordyceps militaris of silkworm larva (CML) were tested for antitumor and immunomodulatory activities in ICR mice bearing sarcoma-180 cells ascites or solid tumor. Mice injected with CMP or CML showed longer survival time compared to the value for control mice injected with saline(p<0.05). Mice injected with CMP or CML showed a inhibition in solid tumor size compared to the value for control mice treated with saline(p<0.05). Mice bearing solid tumor and injected with CMP or CML showed a significantly increased thymus weight(p<0.05), lymphocyte percentages of CD4+ T-cell, CD8+ T-cell, and NK-cell in the spleen, and interleukin-2 excretion by the isolated splenocytes compared to those for control mice (p<0.05). We investigated the induction of apoptosis by Cordyceps militaris of silkworm pupa (CMP) through activation of caspase-3 in the human myeloid leukemia cell line, HL-60. Giemsa statining of HL-60 cells treated with CMP (1 mg/ml) for 16hrs showed a typical apoptosis-specific morphological change. The DNA fragmentation was observed from the agarose gel electrophoresis of cells treated with CMP for 8 hrs or longer, and was progressed to a greater degree as treatment time increases. Treatment of the cells with CMP (1 mg/ml)) resulted in a rapid release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, and a subsequent cleavage of caspase-3 to an active form in a treatment-time dependent manner. CMP (1 mg/ml) also stimulated proteolytic cleavage of poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP) to an active form in HL-60 cells. cDNA microarray results of HL-60 cells indicated that CMP up- or down-regulated the expression of several genes associated with cell proliferation, differentiation, apoptosis, cell cycle, and immune function. CMP-induced differential gene expression was further confirmed by the reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and real time PCR ananlyses. These results indicated that the anti-tumor activity of hot water-extracts of Cordyceps militaris, raised on both silkworm pupa and silkworm larva, are superior to cordycepin, a known active compound of Cordyceps militaris, and appears to be associated with their immunomodulatory activity and CMP appears to induce the apoptosis in human myeloid leukemia cells via a caspase-dependent pathway. We suggest the possible application of Cordyceps militaris as an antiproliferative agent for cancer prevention.
This study was undertaken to evaluate the mechanisms of Cordyceps militaris water extract on anticancer and apoptosis following in vivo and in vitro experimental tests. Hot water-extracts prepared from Cordyceps militaris of silkworm pupa (CMP) or Cordyceps militaris of silkworm larva (CML) were tested for antitumor and immunomodulatory activities in ICR mice bearing sarcoma-180 cells ascites or solid tumor. Mice injected with CMP or CML showed longer survival time compared to the value for control mice injected with saline(p<0.05). Mice injected with CMP or CML showed a inhibition in solid tumor size compared to the value for control mice treated with saline(p<0.05). Mice bearing solid tumor and injected with CMP or CML showed a significantly increased thymus weight(p<0.05), lymphocyte percentages of CD4+ T-cell, CD8+ T-cell, and NK-cell in the spleen, and interleukin-2 excretion by the isolated splenocytes compared to those for control mice (p<0.05). We investigated the induction of apoptosis by Cordyceps militaris of silkworm pupa (CMP) through activation of caspase-3 in the human myeloid leukemia cell line, HL-60. Giemsa statining of HL-60 cells treated with CMP (1 mg/ml) for 16hrs showed a typical apoptosis-specific morphological change. The DNA fragmentation was observed from the agarose gel electrophoresis of cells treated with CMP for 8 hrs or longer, and was progressed to a greater degree as treatment time increases. Treatment of the cells with CMP (1 mg/ml)) resulted in a rapid release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, and a subsequent cleavage of caspase-3 to an active form in a treatment-time dependent manner. CMP (1 mg/ml) also stimulated proteolytic cleavage of poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP) to an active form in HL-60 cells. cDNA microarray results of HL-60 cells indicated that CMP up- or down-regulated the expression of several genes associated with cell proliferation, differentiation, apoptosis, cell cycle, and immune function. CMP-induced differential gene expression was further confirmed by the reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and real time PCR ananlyses. These results indicated that the anti-tumor activity of hot water-extracts of Cordyceps militaris, raised on both silkworm pupa and silkworm larva, are superior to cordycepin, a known active compound of Cordyceps militaris, and appears to be associated with their immunomodulatory activity and CMP appears to induce the apoptosis in human myeloid leukemia cells via a caspase-dependent pathway. We suggest the possible application of Cordyceps militaris as an antiproliferative agent for cancer prevention.
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