젖산균 Leuconostoc mesenteroides 1120의 산성 환경 적응기작에 관한 생리학적 연구 Physiological studies on the adaptation mechanism to the acidic environment of lactic acid bacteria Leuconostoc mesenteroides 1120원문보기
Leuconostoc mesenteroides 1120 균주가 산성 환경 적응시 유발하는 생리적인 변화를 조사하기 위해서, 기초 대사 과정인 해당 과정의 pH 의존성, 세포질내 수소 양이온을 세포 외부로 방출하는 주된 효소계인 막-결합된 ATPase 활성의 pH 의존성, 그리고 그러한 적응 반응중 유발되는 단백질 발현 양상의 변화를 조사하였다. 또한, 이러한 산성 환경 적응기작에 세포질막에 관여된 생리적 변화의 기여도를 확인하기 위하여, ...
Leuconostoc mesenteroides 1120 균주가 산성 환경 적응시 유발하는 생리적인 변화를 조사하기 위해서, 기초 대사 과정인 해당 과정의 pH 의존성, 세포질내 수소 양이온을 세포 외부로 방출하는 주된 효소계인 막-결합된 ATPase 활성의 pH 의존성, 그리고 그러한 적응 반응중 유발되는 단백질 발현 양상의 변화를 조사하였다. 또한, 이러한 산성 환경 적응기작에 세포질막에 관여된 생리적 변화의 기여도를 확인하기 위하여, 수소 이온투과도, 전체 지질로 구성된 리포좀의 안정성, 그리고 막지질 지방산 조성의 변화를 연구하였다. 우선, 산성 환경 적응 기작이 유발된 세포와 그렇지 않은 세포간의 생리적 변화를 극대화하기 위해서, 최대 ATR을 유발하는 조건을 조사하였다 실험 결과, 본 균주는 pH 3.5에서 1시간 배양됨을 통해서 최대 ATR을 획득하였으다. 또한 ATPase의 F_(o) site의 강력한 저해제인 dicyclohexylcarbodiimide와 그램 양성 세균의 단백질 합성 저해제인 chlroamphenicol의 전처리는 ATR의 완전한 유도를 저해하였다. 이러한 결과는 ATR의 완전한 유도가 새로운 단백질의 합성과 증대된 ATPase 활성에 의존됨을 보이는 것이다. ATR을 유도한 세포와 대조구의 해당 작용의 pH 의존성을 비교한 결과, ATR-유도구는 pH 5.5에서 최고 활성을 보여, pH 6.0에서 최대 활성을 보인 대조구보다 약 0.5 pH unit 낮은 값을 보였다. ATR-유도구와 대조구의 세포질막에서 유래된 ATPase 활성의 pH 의존성 실험은 대조구가 pH 6.5에서 0.21 units/mg po린ein을, ATR-유도구가 0.18 units/mg proteins를 보였다. 비록 대조구가 최고 비활성에서는 ATR-유도구보다 높은 값을 보였으나, pH 3.0에서 pH 6.0까지의 측정이 이루워진 산성 환경 전역에서 ATR-유도구가 대조구가 높은 활성을 유지하였다. 수소 이온 투과도는 세포질막의 고유성뿐아니라 세포질막에 결합된 다양한 단백질들의 복합적 기능을 나타내는 지수로, 대조구와 ATR-유도구의 수소 이온 투과도를 다양한 기준 pH에서 측정한 결과, 대조구는 pH 6.0에서 t_(1/2)값이 5.2분, ATR-유도구는 pH 5.0에서 t_(1/2)값이 7.5분으로 가장 낮은 수소 이온 투과도를 나타내었다. ATPase의 Fo site에 결합하여 고유의 기능을 저해함으로써 수소 이온 투과도를 크게 증가시키는 dicyclohexylcarbodiimde를 대조구와 ATR-유도구에 전처리 한 후 pH 4.0에서 수소 이온 투과도를 측정한 결과, 대조구는 t_(1/2)값이 1.0분, ATR-유도구는 t_(1/2)값이 2.6분으로 대조구에 비해 유의적으로 높은 활성을 유지하였다. 이러한 결과는 ATR의 유도를 통해 ATPase의 구조적, 기능적 변화가 유발되었음과 수소 이온을 세포 외부로 방출하는 기작이 대조구와는 달리 전적으로 ATPase에 의존되지 않고 있음을 반증하는 것으로 사료된다. 대조구와 ATR-유도구에서 전체 지질을 추출하여 제조한 리포좀의 안정성을 pH 2.5와 45℃에서 측정한 결과를 보면, ATR-유도구의 리포즘이 대조구 보다 pH 4.5의 산성 shock하에서 약 2.25배 안정한 결과를, 45℃의 열 shock하에서는 약 1.3배 안정함을 보였다. 세포질막은 환경과 생명을 구분짓는 일차적 장벽으로 최근들어 환경 적응에서 그 중요성이 더욱 증대되고 있는데, 산성 환경 적응후 대조구와의 세포질막의 지방산 조성을 분석한 결과, ATR-유도구에서 nonadecanoic acid(C_(cycio19:0))이 크게 증대되었으며, hepatadecenoic acid(C_(l7:1)), stearic acid(C_(18:0)), 그리고 arachidic acid(C_(20:0))의 함량이 증대되었다. ATR-유도구가 보이는 이러한 생리적 변화는 다양한 단백질의 새로운 합성에 의존되는데, 대조구와 ATR-유도구간의 단백질 발현 양상을 이차원 전기영동을 통해서 분석한 결과, ATR 유도를 통하여 23개 단백질들이 새로이 발현되었으며, 9개의 단백질 발현이 억제되었다. 이러한 생리적 변화는 다량의 젖산을 주 대사 산물로 생산하여 필연적으로 환경을 산성화시키는 Leu. mesenteroides 1120균주가 산성 환경에서 호증식을 하는 원인을 설명하는 것으로, 이러한 젖산균종의 산성 환경 적응 기작의 이해는 다양한 산업적 응용의 범위를 넓힐수 있을뿐 아니라 더욱 유용한 균주 개발에 좋은 바탕이 될것으로 생각된다.
Leuconostoc mesenteroides 1120 균주가 산성 환경 적응시 유발하는 생리적인 변화를 조사하기 위해서, 기초 대사 과정인 해당 과정의 pH 의존성, 세포질내 수소 양이온을 세포 외부로 방출하는 주된 효소계인 막-결합된 ATPase 활성의 pH 의존성, 그리고 그러한 적응 반응중 유발되는 단백질 발현 양상의 변화를 조사하였다. 또한, 이러한 산성 환경 적응기작에 세포질막에 관여된 생리적 변화의 기여도를 확인하기 위하여, 수소 이온 투과도, 전체 지질로 구성된 리포좀의 안정성, 그리고 막지질 지방산 조성의 변화를 연구하였다. 우선, 산성 환경 적응 기작이 유발된 세포와 그렇지 않은 세포간의 생리적 변화를 극대화하기 위해서, 최대 ATR을 유발하는 조건을 조사하였다 실험 결과, 본 균주는 pH 3.5에서 1시간 배양됨을 통해서 최대 ATR을 획득하였으다. 또한 ATPase의 F_(o) site의 강력한 저해제인 dicyclohexylcarbodiimide와 그램 양성 세균의 단백질 합성 저해제인 chlroamphenicol의 전처리는 ATR의 완전한 유도를 저해하였다. 이러한 결과는 ATR의 완전한 유도가 새로운 단백질의 합성과 증대된 ATPase 활성에 의존됨을 보이는 것이다. ATR을 유도한 세포와 대조구의 해당 작용의 pH 의존성을 비교한 결과, ATR-유도구는 pH 5.5에서 최고 활성을 보여, pH 6.0에서 최대 활성을 보인 대조구보다 약 0.5 pH unit 낮은 값을 보였다. ATR-유도구와 대조구의 세포질막에서 유래된 ATPase 활성의 pH 의존성 실험은 대조구가 pH 6.5에서 0.21 units/mg po린ein을, ATR-유도구가 0.18 units/mg proteins를 보였다. 비록 대조구가 최고 비활성에서는 ATR-유도구보다 높은 값을 보였으나, pH 3.0에서 pH 6.0까지의 측정이 이루워진 산성 환경 전역에서 ATR-유도구가 대조구가 높은 활성을 유지하였다. 수소 이온 투과도는 세포질막의 고유성뿐아니라 세포질막에 결합된 다양한 단백질들의 복합적 기능을 나타내는 지수로, 대조구와 ATR-유도구의 수소 이온 투과도를 다양한 기준 pH에서 측정한 결과, 대조구는 pH 6.0에서 t_(1/2)값이 5.2분, ATR-유도구는 pH 5.0에서 t_(1/2)값이 7.5분으로 가장 낮은 수소 이온 투과도를 나타내었다. ATPase의 Fo site에 결합하여 고유의 기능을 저해함으로써 수소 이온 투과도를 크게 증가시키는 dicyclohexylcarbodiimde를 대조구와 ATR-유도구에 전처리 한 후 pH 4.0에서 수소 이온 투과도를 측정한 결과, 대조구는 t_(1/2)값이 1.0분, ATR-유도구는 t_(1/2)값이 2.6분으로 대조구에 비해 유의적으로 높은 활성을 유지하였다. 이러한 결과는 ATR의 유도를 통해 ATPase의 구조적, 기능적 변화가 유발되었음과 수소 이온을 세포 외부로 방출하는 기작이 대조구와는 달리 전적으로 ATPase에 의존되지 않고 있음을 반증하는 것으로 사료된다. 대조구와 ATR-유도구에서 전체 지질을 추출하여 제조한 리포좀의 안정성을 pH 2.5와 45℃에서 측정한 결과를 보면, ATR-유도구의 리포즘이 대조구 보다 pH 4.5의 산성 shock하에서 약 2.25배 안정한 결과를, 45℃의 열 shock하에서는 약 1.3배 안정함을 보였다. 세포질막은 환경과 생명을 구분짓는 일차적 장벽으로 최근들어 환경 적응에서 그 중요성이 더욱 증대되고 있는데, 산성 환경 적응후 대조구와의 세포질막의 지방산 조성을 분석한 결과, ATR-유도구에서 nonadecanoic acid(C_(cycio19:0))이 크게 증대되었으며, hepatadecenoic acid(C_(l7:1)), stearic acid(C_(18:0)), 그리고 arachidic acid(C_(20:0))의 함량이 증대되었다. ATR-유도구가 보이는 이러한 생리적 변화는 다양한 단백질의 새로운 합성에 의존되는데, 대조구와 ATR-유도구간의 단백질 발현 양상을 이차원 전기영동을 통해서 분석한 결과, ATR 유도를 통하여 23개 단백질들이 새로이 발현되었으며, 9개의 단백질 발현이 억제되었다. 이러한 생리적 변화는 다량의 젖산을 주 대사 산물로 생산하여 필연적으로 환경을 산성화시키는 Leu. mesenteroides 1120균주가 산성 환경에서 호증식을 하는 원인을 설명하는 것으로, 이러한 젖산균종의 산성 환경 적응 기작의 이해는 다양한 산업적 응용의 범위를 넓힐수 있을뿐 아니라 더욱 유용한 균주 개발에 좋은 바탕이 될것으로 생각된다.
To investigate the physiological changes of lactic acid bacteria induced by the adaptation to acidic environment, pH dependence of glycolysis activity, cytoplasmic membrane-bounded ATPase activity and new protein expression patterns during the adaptive acid tolerance response were studied. Furthermo...
To investigate the physiological changes of lactic acid bacteria induced by the adaptation to acidic environment, pH dependence of glycolysis activity, cytoplasmic membrane-bounded ATPase activity and new protein expression patterns during the adaptive acid tolerance response were studied. Furthermore, related to the cytoplasmic membrane's physiological changes, proton permeability of intact cell, the stability of liposomes composed of total lipid, and fatty acid composition were investigated. First, to obtain the maximal physiological changes between normal and ATR-induced cells, the maximal ATR inducing condition was studied. Maximal acid resistance was observed when this strain was exposed to pH 3.5 for 1hr prior to challenge at pH 2.5, although intermediate levels of protection were induced by exposure to pH values ranging from 3.0 to 6.0. Because chlorarnphenicol, a protein synthesis inhibitor, and dicyclohexylcarbodiimide, a ATPase F_(o) site inhibitor prevented full induction of acid tolerance response, full expression of the ATR required new protein synthesis and inclosed activity of ATPase. The result of pH dependence of glycolysis showed that the ATR-induced cells exhibited higher activities than control cells at acidic pH. And ATR-induced cells marked maximal glycolysis activities at pH 5.5, this pH was lower than control cells at the degree of 0.5 pH unit. The pH and maximal specific activities of ATPase originated from the control and ATR-induced cells were 0.21 units at pH 6.5 and 0.18 units at pH 5.5, repectively. Although the maximal specific activity of ATPase originated from ATR-induced cells was not higher than control cells, the overall ATPase acitivities of ATR-induced cells were higher than control cells at pH values ranging from 3.0 to 6.0. The proton permeability represents the membrane's integrity composed of membrane's physical charcteristics and membrane-bounded enzyme's functions. Assessment of the movement of protons into control and ATR-induced cells after an acid pulse at various pH values indicated permeability to protons were minimal at pH values about 6.0 and 5.0, at which the average half time for pH equilibration across the cell membrane were about 5.2 and 7.5 min, respectively. The ATPase inhibitor dicyclohexylarbodiimide acted to increase the permeability of control cells to protons at higher values than the ATR-induced cells, and this action indicated that the ATR-induced cells were more dependent on the no energy-consumping mechanisms for pumping out protons than control cells. The corresponding value for DCCD-treated control cells was 1.0min, and the value for the DCCD-treated, ATR-induced cells was 2.6min at the same pH 4.0. Liposomes composed of total cellular lipids extracted from the control and ATR-induced cells were analyzed for their stability at pH 2.5 shock and at 45℃ thermal shock conditions. At pH 2.5, ATR-induced cells' liposomes were considerably more stable about 2.25 times than liposomes of control cells. And the liposomes of ATR-induced cells acquired additional stability at 45℃ against thermal stress. Recently the questions were asked as to what kind of the changes of fatty acids composition during acid tolerance response caused the increased growth in the acidic environment. As acid tolerance response was acquired, nonadecanoic acid(C19:Ocyclo) were markedly increased and hepatadecenoic acid(Cl7:1), stearic acid(Cl8:0), and arachidic acid(C20:0) were slightly changed. Analysis of protein expression during the acid tolerance response by two-dimensional gel electrophoresis revealed a change in the expression of at least 31 proteins compared to the control clells. 23 proteins showed induced expression while 9 proteins were repressed. This result implied that the ATR is a complex response involving a modulation in the expression of many genes. These data reported here suggest that Leu. mesenteroides develops acid tolerance response upon exposure to prior, sublethal acid conditions. This ATR includes adaptive changes of the membrane as well as many other physiological changes. And full acquisition of ATR induced the new synthesis of proteins and additional non-energy consumping mechanisms for pumping out protons. These physiological observations about lactic acid bacteria's adaptive mechanism to acidic environment will increase the possibilities of industrial application and development of more useful bacterial strains.
To investigate the physiological changes of lactic acid bacteria induced by the adaptation to acidic environment, pH dependence of glycolysis activity, cytoplasmic membrane-bounded ATPase activity and new protein expression patterns during the adaptive acid tolerance response were studied. Furthermore, related to the cytoplasmic membrane's physiological changes, proton permeability of intact cell, the stability of liposomes composed of total lipid, and fatty acid composition were investigated. First, to obtain the maximal physiological changes between normal and ATR-induced cells, the maximal ATR inducing condition was studied. Maximal acid resistance was observed when this strain was exposed to pH 3.5 for 1hr prior to challenge at pH 2.5, although intermediate levels of protection were induced by exposure to pH values ranging from 3.0 to 6.0. Because chlorarnphenicol, a protein synthesis inhibitor, and dicyclohexylcarbodiimide, a ATPase F_(o) site inhibitor prevented full induction of acid tolerance response, full expression of the ATR required new protein synthesis and inclosed activity of ATPase. The result of pH dependence of glycolysis showed that the ATR-induced cells exhibited higher activities than control cells at acidic pH. And ATR-induced cells marked maximal glycolysis activities at pH 5.5, this pH was lower than control cells at the degree of 0.5 pH unit. The pH and maximal specific activities of ATPase originated from the control and ATR-induced cells were 0.21 units at pH 6.5 and 0.18 units at pH 5.5, repectively. Although the maximal specific activity of ATPase originated from ATR-induced cells was not higher than control cells, the overall ATPase acitivities of ATR-induced cells were higher than control cells at pH values ranging from 3.0 to 6.0. The proton permeability represents the membrane's integrity composed of membrane's physical charcteristics and membrane-bounded enzyme's functions. Assessment of the movement of protons into control and ATR-induced cells after an acid pulse at various pH values indicated permeability to protons were minimal at pH values about 6.0 and 5.0, at which the average half time for pH equilibration across the cell membrane were about 5.2 and 7.5 min, respectively. The ATPase inhibitor dicyclohexylarbodiimide acted to increase the permeability of control cells to protons at higher values than the ATR-induced cells, and this action indicated that the ATR-induced cells were more dependent on the no energy-consumping mechanisms for pumping out protons than control cells. The corresponding value for DCCD-treated control cells was 1.0min, and the value for the DCCD-treated, ATR-induced cells was 2.6min at the same pH 4.0. Liposomes composed of total cellular lipids extracted from the control and ATR-induced cells were analyzed for their stability at pH 2.5 shock and at 45℃ thermal shock conditions. At pH 2.5, ATR-induced cells' liposomes were considerably more stable about 2.25 times than liposomes of control cells. And the liposomes of ATR-induced cells acquired additional stability at 45℃ against thermal stress. Recently the questions were asked as to what kind of the changes of fatty acids composition during acid tolerance response caused the increased growth in the acidic environment. As acid tolerance response was acquired, nonadecanoic acid(C19:Ocyclo) were markedly increased and hepatadecenoic acid(Cl7:1), stearic acid(Cl8:0), and arachidic acid(C20:0) were slightly changed. Analysis of protein expression during the acid tolerance response by two-dimensional gel electrophoresis revealed a change in the expression of at least 31 proteins compared to the control clells. 23 proteins showed induced expression while 9 proteins were repressed. This result implied that the ATR is a complex response involving a modulation in the expression of many genes. These data reported here suggest that Leu. mesenteroides develops acid tolerance response upon exposure to prior, sublethal acid conditions. This ATR includes adaptive changes of the membrane as well as many other physiological changes. And full acquisition of ATR induced the new synthesis of proteins and additional non-energy consumping mechanisms for pumping out protons. These physiological observations about lactic acid bacteria's adaptive mechanism to acidic environment will increase the possibilities of industrial application and development of more useful bacterial strains.
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