연구배경 및 목적 : Gliotoxin은 epipolythiodioxopiperazine (ETP) 계열의 화합물로써 Aspergillus fumigatus, candida 그리고 penicillum 종에서 생산되는 이차대사산물이다. 이 균독소의 생물학적 특성으로 in vivo와 in vitro 양쪽 모두에서 면역억제 효과가 보고되어 있다. 염증성 대장질환은 크게 ...
연구배경 및 목적 : Gliotoxin은 epipolythiodioxopiperazine (ETP) 계열의 화합물로써 Aspergillus fumigatus, candida 그리고 penicillum 종에서 생산되는 이차대사산물이다. 이 균독소의 생물학적 특성으로 in vivo와 in vitro 양쪽 모두에서 면역억제 효과가 보고되어 있다. 염증성 대장질환은 크게 궤양성 대장염과 크론씨병으로 나누어지는데 아직까지 원인에 대해서는 정확하게 알려진 바가 없다. 또한 gliotoxin이 면역억제 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 염증성 대장질환에서의 gliotoxin이 미치는 영향에 관한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구를 통하여 gliotoxin이 TNBS에 의해 유도된 염증성 대장염에 미치는 효과를 살펴보고자 하였다. 방법 : 1. 사람의 대장내피세포인 HT-29세포주를 이용하여 TNF-α와 IL-1β로 자극한 세포에 gliotoxin을 1시간 전처리하여 IL-8의 발현과 IκBα의 붕괴를 억제하는지 관찰하였다. 또한 gliotoxin이 MAPK 와 HO-1과 그리고 염증에 의한 ICAM-1의 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 2. 마우스 동물모델에 크론씨 병을 유발하기 위해서 TNBS를 1일과 7일째에 항문으로 100μl를 주입하였으며, gliotoxin의 효과를 살펴보기 위해서 gliotoxin을 0일, 3일 그리고 6일째에 1㎍/g씩 항문 주입 하였다. 각각의 조건에 따른 마우스에서 염증의 억제정도를 육안적 및 조직학적 관찰을 통하여 측정하였으며, 조직에서 MPO 및 HO-1 그리고 NF-κB의 활성여부를 측정하였다. 3. Gliotoxin에 의한 항염효과에 있어서 HO-1의 역할을 규명하기 위해서 HO-1의 억제제인 ZnPPIX를 gliotoxin과 같은 시기에 주입하였다. 4. TNBS에 의한 크론씨 병 모델 마우스에서 MAPK의 역할을 살펴 보기 위해서 MAPK의 억제제를 마우스에 처리하여 염증의 심화정도를 살펴 보았다. 결과: 1. 사람의 대장내피세포인 HT-29에 TNF-α와 IL-1β를 처리한 결과 IL-8의 발현이 대조군에 비하여 약 10배 증가하였으며 gliotoxin을 농도별로 처리한 결과 농도 의존적으로 TL-8의 발현이 감소하여 TNF-α는 0.2 ㎍/ml에서 그리고 IL-1β는 0.3 ㎍/ml에서 각각 IC_(50)을 나타내었다. 2. Gliotoxin을 전처리한 HT-29세포에서 TNF-α와 IL-1β에 의한 IκBα의 붕괴가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다. 3. NF-α와 IL-1β를 처리한 HT-29세포에서 p38과 ERK의 인산화 반응이 일어났으며 gliotoxin을 전처리한 세포에서도 이들 인산화 반응이 나타났다. 또한 TNF-α를 처리한 세포에 p38의 억제제인 SB 202190을 처리한 결과 IκBα의 붕괴를 억제시키지 못하였다. 4. Gliotoxin을 단독 처리한 군과 TNF-α를 같이 처리한 군 모두에서 HO-1의 발현이 72시간에서 나타났으며, TNF-α에 의한 ICAM-1의 발현이 gliotoxin을 처리한 결과 억제 되었다. 그러나 HO-1의 억제제일 ZnPPIX를 gliotoxin과 같이 전처리한 군에서는 TNF-α에 의한 ICAM-1의 발현을 gliotoxin이 억제하지 못하였다. 5. TNBS에 의해 유도된 염증성 대장염 마우스 모델에 gliotoxin을 처리한 결과 임상적 (체중변화, 대장의 무게 및 두께 그리고 손상정도) 그리고 조직병리학적 결과에서 TNBS 단독처리 군에 비하여 염증이 억제되는 것을 확인하였다. 6. 실험 9일째 마우스에서는 gliotoxin을 처리한 군에서 대장의 손상정도가 현저히 억제되었으며 손상 정도를 수치화 하여 살펴 본 결과 TNBS 단독처리군에서는 9.6이었으나 gliotoxin을 처리한 군에서 2.8로 손상 수치가 감소되는 것을 볼 수 있었다. 7. MPO를 측정한 결과 gliotoxin을 처리한 군에서 TNBS를 단독으로 처리한 군에서의 MPO 수치의 증가를 억제하여 거의 대조군 수준으로 낮아졌다. 8. NBS를 처리한 군에 gliotoxin을 처리한 마우스에서 IκB의 붕괴에 의한 NF-κB의 활성을 억제시켰다. 9. Gliotoxin을 TNBS 투여한 군과 비 투여군 모두에서 HO-1의 발현이 3일째와 9일째 모두 증가하는 것이 나타났다. 결론: 이상의 결과들을 통하여 TNBS에 의한 염증성 대장염 모델에서 HO-1이 염증을 억제하는데 있어서 중요한 역할을 담당하며 gliotoxin이 HO-1의 발현을 증가시킴으로써 NF-κB와 ICAM-1의 발현을 억제시켜 항염효과를 나타내는 것으로 생각된다.
연구배경 및 목적 : Gliotoxin은 epipolythiodioxopiperazine (ETP) 계열의 화합물로써 Aspergillus fumigatus, candida 그리고 penicillum 종에서 생산되는 이차대사산물이다. 이 균독소의 생물학적 특성으로 in vivo와 in vitro 양쪽 모두에서 면역억제 효과가 보고되어 있다. 염증성 대장질환은 크게 궤양성 대장염과 크론씨병으로 나누어지는데 아직까지 원인에 대해서는 정확하게 알려진 바가 없다. 또한 gliotoxin이 면역억제 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 염증성 대장질환에서의 gliotoxin이 미치는 영향에 관한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구를 통하여 gliotoxin이 TNBS에 의해 유도된 염증성 대장염에 미치는 효과를 살펴보고자 하였다. 방법 : 1. 사람의 대장내피세포인 HT-29세포주를 이용하여 TNF-α와 IL-1β로 자극한 세포에 gliotoxin을 1시간 전처리하여 IL-8의 발현과 IκBα의 붕괴를 억제하는지 관찰하였다. 또한 gliotoxin이 MAPK 와 HO-1과 그리고 염증에 의한 ICAM-1의 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 2. 마우스 동물모델에 크론씨 병을 유발하기 위해서 TNBS를 1일과 7일째에 항문으로 100μl를 주입하였으며, gliotoxin의 효과를 살펴보기 위해서 gliotoxin을 0일, 3일 그리고 6일째에 1㎍/g씩 항문 주입 하였다. 각각의 조건에 따른 마우스에서 염증의 억제정도를 육안적 및 조직학적 관찰을 통하여 측정하였으며, 조직에서 MPO 및 HO-1 그리고 NF-κB의 활성여부를 측정하였다. 3. Gliotoxin에 의한 항염효과에 있어서 HO-1의 역할을 규명하기 위해서 HO-1의 억제제인 ZnPPIX를 gliotoxin과 같은 시기에 주입하였다. 4. TNBS에 의한 크론씨 병 모델 마우스에서 MAPK의 역할을 살펴 보기 위해서 MAPK의 억제제를 마우스에 처리하여 염증의 심화정도를 살펴 보았다. 결과: 1. 사람의 대장내피세포인 HT-29에 TNF-α와 IL-1β를 처리한 결과 IL-8의 발현이 대조군에 비하여 약 10배 증가하였으며 gliotoxin을 농도별로 처리한 결과 농도 의존적으로 TL-8의 발현이 감소하여 TNF-α는 0.2 ㎍/ml에서 그리고 IL-1β는 0.3 ㎍/ml에서 각각 IC_(50)을 나타내었다. 2. Gliotoxin을 전처리한 HT-29세포에서 TNF-α와 IL-1β에 의한 IκBα의 붕괴가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다. 3. NF-α와 IL-1β를 처리한 HT-29세포에서 p38과 ERK의 인산화 반응이 일어났으며 gliotoxin을 전처리한 세포에서도 이들 인산화 반응이 나타났다. 또한 TNF-α를 처리한 세포에 p38의 억제제인 SB 202190을 처리한 결과 IκBα의 붕괴를 억제시키지 못하였다. 4. Gliotoxin을 단독 처리한 군과 TNF-α를 같이 처리한 군 모두에서 HO-1의 발현이 72시간에서 나타났으며, TNF-α에 의한 ICAM-1의 발현이 gliotoxin을 처리한 결과 억제 되었다. 그러나 HO-1의 억제제일 ZnPPIX를 gliotoxin과 같이 전처리한 군에서는 TNF-α에 의한 ICAM-1의 발현을 gliotoxin이 억제하지 못하였다. 5. TNBS에 의해 유도된 염증성 대장염 마우스 모델에 gliotoxin을 처리한 결과 임상적 (체중변화, 대장의 무게 및 두께 그리고 손상정도) 그리고 조직병리학적 결과에서 TNBS 단독처리 군에 비하여 염증이 억제되는 것을 확인하였다. 6. 실험 9일째 마우스에서는 gliotoxin을 처리한 군에서 대장의 손상정도가 현저히 억제되었으며 손상 정도를 수치화 하여 살펴 본 결과 TNBS 단독처리군에서는 9.6이었으나 gliotoxin을 처리한 군에서 2.8로 손상 수치가 감소되는 것을 볼 수 있었다. 7. MPO를 측정한 결과 gliotoxin을 처리한 군에서 TNBS를 단독으로 처리한 군에서의 MPO 수치의 증가를 억제하여 거의 대조군 수준으로 낮아졌다. 8. NBS를 처리한 군에 gliotoxin을 처리한 마우스에서 IκB의 붕괴에 의한 NF-κB의 활성을 억제시켰다. 9. Gliotoxin을 TNBS 투여한 군과 비 투여군 모두에서 HO-1의 발현이 3일째와 9일째 모두 증가하는 것이 나타났다. 결론: 이상의 결과들을 통하여 TNBS에 의한 염증성 대장염 모델에서 HO-1이 염증을 억제하는데 있어서 중요한 역할을 담당하며 gliotoxin이 HO-1의 발현을 증가시킴으로써 NF-κB와 ICAM-1의 발현을 억제시켜 항염효과를 나타내는 것으로 생각된다.
Back ground and object: Gliotoxin is a fungal metabolite and classified as an epipolythiodioxopiperzin (ETP) analog. This fungal metabolite exhibits potent immunosuppressive effects both in vitro and in vivo. The most common types of inflammatory bowel disease (IBD) are Crohn's disease and Ulcerativ...
Back ground and object: Gliotoxin is a fungal metabolite and classified as an epipolythiodioxopiperzin (ETP) analog. This fungal metabolite exhibits potent immunosuppressive effects both in vitro and in vivo. The most common types of inflammatory bowel disease (IBD) are Crohn's disease and Ulcerative colitis. But little studies have been carried out between gliotoxin and IBD. So the present study was conducted to investigate the efficiency of gliotoxin against experimental TNBS-induced colitis. First, I determined if gliotoxin could inhibit TNF-α and IL-1β-stimulated IL-8 secretion, as well as IκBα degradation, in a human epithelial cell line (HT-29). To investigated whether gliotoxin regulated MAP kinase pathway, adhesion protein (ICAM-1) and heme oxygenase system in cytokine-induced HT-29 cell line. Second, I evaluated whether gliotoxin could inhibit TNBS-induced colitis in mice. Mice (preventive animal model of gliotoxin) were treated with TNBS at 1 day and 7 day and gliotoxin at 0 day, 3 day, and 6 day and then mice were sacrificed at 9 day for experiments. A gross colonic injury score, myeloperoxidase (MPO), heme oxygenase-1 activity and NF- κB activity were all evaluated. And I explored the effect of the specific MAPK inhibitor SB 203580 and PD 098509 in TNBS induced colitis, murine model of Crohn's disease. TNF-α (1 ng/ml) and IL-1β(1 ng/ml) increased IL-8 production representing 10 folds increase compared with control in HT-29 cells. Gliotoxin dose dependently inhibited IL-8 production in vitro. The calculated IC_(50) values of gliotoxin were TNF-α (0.2 ㎍/ml) and IL-1β(0.3 ㎍/ml). Interestingly gliotoxin also effectively inhibited TNF-α and IL-1β induced IκBα degradation. The p38 and ERK MAP kinase is induced following HT-29 cell by cytokine stimulation. Interestingly, cytokine-induced p38 and ERK phosphorylation were not inhibited by gliotoxin treatment. In addition, p38 phosphorylation inhibitor, SB202190, did not inhibition of IκBα degradation by TNF-α stimulation. Enhanced HO-1 expression was observed 72 hr after gliotoxin-treated with or without cytokine stimulated in HT-29 cell lines. In human intestinal epithelial cell line, TNF-α induced a strong activation of the expression of ICAM-1. HO-1 inhibitor, ZnPPIX, the more increase than cytokine alone-induced ICAM-1. In mice treated with gliotoxin, clinical (body weight, weight and thickness of colon, and injury score) and histopathological findings of TNBS-induced colitis were significantly less than in mice with TNBS-induced colitis not treated with gliotoxin. On day 9, gliotoxin significantly reduced gross colonic injury in mice. And the average damage score was significantly lower in gliotoxin and TNBS both treated mice (2.8) than TNBS treated mice (9.6). The colonic level of MPO was also partially normalized in gliotoxin treated mice. Gliotoxin inhibited NF-κB activation via IκB degradation mice with TNBS-induced colitis. In the gliotoxin treated with or without TNBS-induced colitis, HO-1 expression not reduced at 3 and 9 days. These results demonstrate HO-1 plays a protective role in the colonic damage induced by the TNBS enema, and the preventive effects of gliotoxin probably result from inhibited NF-κB and ICAM-1 products through enhanced HO-1.
Back ground and object: Gliotoxin is a fungal metabolite and classified as an epipolythiodioxopiperzin (ETP) analog. This fungal metabolite exhibits potent immunosuppressive effects both in vitro and in vivo. The most common types of inflammatory bowel disease (IBD) are Crohn's disease and Ulcerative colitis. But little studies have been carried out between gliotoxin and IBD. So the present study was conducted to investigate the efficiency of gliotoxin against experimental TNBS-induced colitis. First, I determined if gliotoxin could inhibit TNF-α and IL-1β-stimulated IL-8 secretion, as well as IκBα degradation, in a human epithelial cell line (HT-29). To investigated whether gliotoxin regulated MAP kinase pathway, adhesion protein (ICAM-1) and heme oxygenase system in cytokine-induced HT-29 cell line. Second, I evaluated whether gliotoxin could inhibit TNBS-induced colitis in mice. Mice (preventive animal model of gliotoxin) were treated with TNBS at 1 day and 7 day and gliotoxin at 0 day, 3 day, and 6 day and then mice were sacrificed at 9 day for experiments. A gross colonic injury score, myeloperoxidase (MPO), heme oxygenase-1 activity and NF- κB activity were all evaluated. And I explored the effect of the specific MAPK inhibitor SB 203580 and PD 098509 in TNBS induced colitis, murine model of Crohn's disease. TNF-α (1 ng/ml) and IL-1β(1 ng/ml) increased IL-8 production representing 10 folds increase compared with control in HT-29 cells. Gliotoxin dose dependently inhibited IL-8 production in vitro. The calculated IC_(50) values of gliotoxin were TNF-α (0.2 ㎍/ml) and IL-1β(0.3 ㎍/ml). Interestingly gliotoxin also effectively inhibited TNF-α and IL-1β induced IκBα degradation. The p38 and ERK MAP kinase is induced following HT-29 cell by cytokine stimulation. Interestingly, cytokine-induced p38 and ERK phosphorylation were not inhibited by gliotoxin treatment. In addition, p38 phosphorylation inhibitor, SB202190, did not inhibition of IκBα degradation by TNF-α stimulation. Enhanced HO-1 expression was observed 72 hr after gliotoxin-treated with or without cytokine stimulated in HT-29 cell lines. In human intestinal epithelial cell line, TNF-α induced a strong activation of the expression of ICAM-1. HO-1 inhibitor, ZnPPIX, the more increase than cytokine alone-induced ICAM-1. In mice treated with gliotoxin, clinical (body weight, weight and thickness of colon, and injury score) and histopathological findings of TNBS-induced colitis were significantly less than in mice with TNBS-induced colitis not treated with gliotoxin. On day 9, gliotoxin significantly reduced gross colonic injury in mice. And the average damage score was significantly lower in gliotoxin and TNBS both treated mice (2.8) than TNBS treated mice (9.6). The colonic level of MPO was also partially normalized in gliotoxin treated mice. Gliotoxin inhibited NF-κB activation via IκB degradation mice with TNBS-induced colitis. In the gliotoxin treated with or without TNBS-induced colitis, HO-1 expression not reduced at 3 and 9 days. These results demonstrate HO-1 plays a protective role in the colonic damage induced by the TNBS enema, and the preventive effects of gliotoxin probably result from inhibited NF-κB and ICAM-1 products through enhanced HO-1.
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