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문제 정의
- 또한 환제로 만들어 비교하기에는 각 동물마다 일정한 투여량을 확보하기 어려워 분말로 만들어 식염수에 타서 음료로 만들어 zonde로 경구투여하였다. OMH 및 MF 단독제제을 투여하였을 때의 염증성 장질환에 대한 억제효과를 비교분석하기 위하여 체중, 대장길이, cytokine, CBC, 조직검사 등을 측정하고 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 烏梅가 포함된 처방들 중 대표적인 烏梅丸은 ≪金匱要略≫16에 吐蛔 및 久痢를 치료한다고 기재되어 있다. 그러나, 현재까지 염증성 장질환에 대한 오매환과 오매의 효능차이에 대한 비교실험 연구가 없었으며, Dextran Sulfate Sodium(DSS)로 궤양성 대장염을 유발한 실험이 없었던바 이에 저자는 烏梅 단독제제와 烏梅丸을 염증성 장질환 유발 동물모델에 경구 투여하여 체중 변화, 대장 길이 변화, cytokine(TNF-α, IL-10) 및 CBC(WBC, RBC, Hb, PLT) 변화, 조직학적 변화 등을 비교 분석하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 실험군은 정상군(normal group, 이하 NG, n=10), 대조군(control group, 이하 CG, n=11), 烏梅 투여군(MF group, 이하 MFG, n=11), 烏梅丸 투여군(OMH group, 이하 OMHG, n=11)으로 총 4개 군으로 구분하였다. CG, MFG, OMH에서 예상치 못한 죽음 등을 대비해 1마리씩 늘려서 실험하였는데, 실험 중 CG에서 1마리가 죽어버려 결과는 1마리 누락시키고 도출하였다. 실험도중 NG는 실험기간 동안 DSS가 포함되지 않은 음료와 정상적인 사료를 섭취케하여 기타 아무런 처치를 하지 않은 군으로 설정하고, CG는 DSS가 포함된 수용액을 섭취케 하고 약물 대신 증류수를 투여한 군으로 설정하였다.
- DSS 투여 및 시료의 투여가 대장 점막에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 희생시킨 생쥐의 대장 조직을 적출한 후 H&E로 염색하고 이를 관찰하였다
- DSS 투여 및 시료의 투여에 따른 체중을 변화를 관찰하기 위하여 실험기간 동안 생쥐의 체중을 DSS 투여 후 2일에 한 번씩 오전 10시에 총 4회에 걸쳐 측정하였다.
- )을 투여하는 방법을 이용하였다. DSS에 의한 유발방법은 기존 DSS를 유발한 방법17을 참고하여 1주간 사육장에서 순화시켰던 ICR계 군들 중 NG를 제외한, CG, MFG 및 OMHG에게 5%(w/v) DSS가 함유된 물에 넣어 음용수로 10일 동안 자유롭게 섭취하게 하여 대장염을 유발하였다. DSS를 투여한 군들은 설사 및 혈변을 관찰할 수 있었고, 식사량 감소등을 확인할 수 있었다.
- 실험도중 NG는 실험기간 동안 DSS가 포함되지 않은 음료와 정상적인 사료를 섭취케하여 기타 아무런 처치를 하지 않은 군으로 설정하고, CG는 DSS가 포함된 수용액을 섭취케 하고 약물 대신 증류수를 투여한 군으로 설정하였다. MFG는 DSS를 투여한 후 MF 전탕액을 500 mg/kg 농도로 1일 1회 zonde를 이용하여 경구투여 하였으며, OMHG는 DSS를 투여한 후 OMH 전탕액을 500 mg/kg 농도로 1일 1회 zonde를 이용하여 경구투여 하였다. 투여기간은 1주일 순화 후 NG를 제외한 나머지 실험군에 DSS를 3일간 투여하여 대장염 유발 확인 후 4일째부터 7일간 DSS와 함께 CG에는 증류수를, MFG에는 MF 전탕액을, OMHG에는 OMH 전탕액을 경구투여 하였다.
- 대장염 병태모델 유발은 Dextran Sulfate Sodium(DSS, Sigma, U.S.A.)을 투여하는 방법을 이용하였다. DSS에 의한 유발방법은 기존 DSS를 유발한 방법17을 참고하여 1주간 사육장에서 순화시켰던 ICR계 군들 중 NG를 제외한, CG, MFG 및 OMHG에게 5%(w/v) DSS가 함유된 물에 넣어 음용수로 10일 동안 자유롭게 섭취하게 하여 대장염을 유발하였다.
- 모든 실험을 마친 후 생쥐에서 채혈된 혈액에서 염증성 cytokine 중 하나인 TNF-α, IL-10를 측정하였다. TNF-α가 다량 분비될 경우 염증의 전사인자 NF-kB를 활성화시키며 그 결과 prostaglandins, leukotrienes, NO, platelet activating factor 등의 매개물질들의 합성이 증가되고 조직의 손상을 유도하는 각종 염증질환을 일으킨다28.
- 생쥐의 체중을 DSS 투여 후 2일에 한 번씩 아침 10시에 총 4회에 걸쳐 측정하였다. 그 결과를 보면 DSS를 투여하지 않은 NG에 비해 DSS를 투여한 다른 실험군에서 체중의 증가속도가 완만해지며, CG와 MFG은 6일차를 정점으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.
- 실험군은 정상군(normal group, 이하 NG, n=10), 대조군(control group, 이하 CG, n=11), 烏梅 투여군(MF group, 이하 MFG, n=11), 烏梅丸 투여군(OMH group, 이하 OMHG, n=11)으로 총 4개 군으로 구분하였다. CG, MFG, OMH에서 예상치 못한 죽음 등을 대비해 1마리씩 늘려서 실험하였는데, 실험 중 CG에서 1마리가 죽어버려 결과는 1마리 누락시키고 도출하였다.
- CG, MFG, OMH에서 예상치 못한 죽음 등을 대비해 1마리씩 늘려서 실험하였는데, 실험 중 CG에서 1마리가 죽어버려 결과는 1마리 누락시키고 도출하였다. 실험도중 NG는 실험기간 동안 DSS가 포함되지 않은 음료와 정상적인 사료를 섭취케하여 기타 아무런 처치를 하지 않은 군으로 설정하고, CG는 DSS가 포함된 수용액을 섭취케 하고 약물 대신 증류수를 투여한 군으로 설정하였다. MFG는 DSS를 투여한 후 MF 전탕액을 500 mg/kg 농도로 1일 1회 zonde를 이용하여 경구투여 하였으며, OMHG는 DSS를 투여한 후 OMH 전탕액을 500 mg/kg 농도로 1일 1회 zonde를 이용하여 경구투여 하였다.
- 오매와 오매환이 DSS로 염증성 장질환이 유발된 생쥐의 체중 변화, 대장 길이 변화, 혈청 중 cytokine(TNF-α, IL-10) 및 CBC(WBC, RBC, Hb, PLT) 함량의 변화, 조직학적 변화를 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 또한 TNBS 유발 장염이 크론병과 임상 양상이나 기전이 비교적 유사하고, DSS유발 장염은 염증세포의 점막침윤, 상피세포의 손상, 궤양을 특징으로 하며 사람의 궤양성 대장염과 비슷하다는 것이 보인다고 보고되어 있다25. 이에 저자는 DSS를 이용하여 궤양성 대장염을 고려하여 염증성 장질환을 유도하였다.
- 또한 최근 염증성 장질환에 대한 다양한 연구가 시도되고 있고, 염증성 장질환에 효과가 있는 烏梅丸과 매실 혼합물에 대한 실험적 연구는 있었지만12,13, 기존 연구에 사용된 오매환은 중국의 국가 식품 의약품 안전청에 의해 승인받은 환제로 Tongrentang에서 구입하여 사용하였는데 약제들의 구성이 다소 ≪金匱要略≫16과 다르다. 이에 저자는 ≪金匱要略≫16에 근거한 약제를 선택하여 포제한 후 烏梅丸 탕약을 만들어 오매와 비교하였다. 원방에서는 桂枝를 去皮하여 사용하라 했지만 금궤요략에 쓰인 약제는 육계로 추정되기에 肉桂로 교체 후 去皮하였다.
- MFG는 DSS를 투여한 후 MF 전탕액을 500 mg/kg 농도로 1일 1회 zonde를 이용하여 경구투여 하였으며, OMHG는 DSS를 투여한 후 OMH 전탕액을 500 mg/kg 농도로 1일 1회 zonde를 이용하여 경구투여 하였다. 투여기간은 1주일 순화 후 NG를 제외한 나머지 실험군에 DSS를 3일간 투여하여 대장염 유발 확인 후 4일째부터 7일간 DSS와 함께 CG에는 증류수를, MFG에는 MF 전탕액을, OMHG에는 OMH 전탕액을 경구투여 하였다. DSS투여 후 11일째 생쥐를 희생시켰다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 烏梅丸(Ohmaehwan, OMH)의 구성약재와 烏梅(Mume Fructus, MF)는 모두 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다. OMH는 ≪金匱要略≫16을 기준으로 선정 및 포제하였다.
- 본 실험에 사용한 실험동물은 7주령의 체중 30±5 g 내외의 웅성 ICR계 생쥐를 실험동물 전문회사인 (주)샘타코에서 구입하여 사용하였다. 구입하기 전 동신대학교 실험동물윤리위원회의 승인(승인번호 : 2014-09-06-02)을 획득하였다.
데이터처리
- 데이터는 one-way ANOVA 방법을 사용하여 통계적 유의성을 검증하였고 통계적으로 유의한 경우 사후검정은 Tukey 방법을 시행하였다
성능/효과
- 구입하기 전 동신대학교 실험동물윤리위원회의 승인(승인번호 : 2014-09-06-02)을 획득하였다. 구입한 생쥐는 1주일간 항온항습 장치가 구비된 사육장(실내온도 24±2 ℃, 습도 55±5%, 12시간 명암주기)에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 적응시킨 후 사용하였다.
- 1% 감소하였고, 오매환 투여군은 0.3% 감소하였으나 통계적으로 유의하지 았았다. Hb와 PLT는 유의성이 없었다.
- RBC는 정상군에 비해 대조군은 3.4% 감소, 오매 투여군은 4.1% 감소하였고, 오매환 투여군은 0.
- DSS 및 시료의 투여를 의한 각 군의 상태 중 대장의 길이를 통해 염증정도를 간접적으로 관찰하기 위하여 대장의 길이를 측정한 결과 NG는 7.72±1.01 cm, CG는 6.56±0.60 cm, MFG는 7.66±1.16 cm, OMHG는 7.67 cm로 나타나 NG가 가장 길었고 CG는 정상길이에 비해 84% 정도의 길이가 측정되었다. MFG(P=0.
- DSS와 시료의 투여가 생쥐의 WBC에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 측정한 결과 CG는 1.54±0.40 K/μl으로 NG(1.09±0.34 K/μl)에 비해 큰 폭으로 상승하였으나 MFG(1.02±0.35 K/μl, p=0.037)와 OMHG(1.04±0.27 K/μl, p=0.035)는 모두 CG에 비해 유의하게 감소하였다. WBC는 전통적으로 감염질환 여부를 알아내는 주요한 수단이였다.
- 3% 감소하였으나 통계적으로 유의하지 았았다. Hb와 PLT는 유의성이 없었다.
- 그 외에도 나이, 성, 임신, 흡연 여부에 따라 영향을 받는 것으로 알려져 있다. MFG와 OMHG에서 모두 CG에 비해 유의하게 감소한 것으로 보아 DSS로 유발된 염증성 장질환이 호전되었음을 확인할 수 있었다.
- 5% 감소하였다. RBC는 정상군에 비해 대조군은 3.4% 감소, 오매 투여군은 4.1% 감소하였고, 오매환 투여군은 0.3% 감소하였으나 통계적으로 유의하지 았았다. Hb와 PLT는 유의성이 없었다.
- 3. TNF-α는 대조군은 정상군에 비해 19% 증가하였고, 오매 투여군과 오매환 투여군은 대조군의 89% 수준으로 감소하였다. IL-10은 유의성이 없었다.
- 4. WBC는 대조군은 정상군에 비해 41% 증가하였고, 대조군과 비교하여 오매 투여군은 33.8% 감소, 오매환 투여군은 32.5% 감소하였다. RBC는 정상군에 비해 대조군은 3.
- 그 결과 CG에서는 대장 점막조직의 훼손이 현저하게 관찰되었고 혈변도 관찰되었으나 MFG와 OMHG는 NG수준으로 점막층이 재생되어 있는 것이 관찰되었다(Fig
- 그 결과를 보면 DSS 투여 후 식염수를 투여한 CG에서는 대장 점막조직의 훼손이 현저하게 관찰되었고 혈변도 관찰되었으나 MFG와 OMHG는 NG 수준으로 점막층이 재생되어 있음이 관찰되었다
- 생쥐의 체중을 DSS 투여 후 2일에 한 번씩 아침 10시에 총 4회에 걸쳐 측정하였다. 그 결과를 보면 DSS를 투여하지 않은 NG에 비해 DSS를 투여한 다른 실험군에서 체중의 증가속도가 완만해지며, CG와 MFG은 6일차를 정점으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 반면 OMHG는 다소 완만하지만 6일차 이후에도 꾸준히 증가하는 경향이 보였다.
- 이는 생쥐의 긴장상태나 DSS의 농도에 따라 유발된 염증 정도가 달라 결과에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다27. 그러나 CG와 MFG에 비해 OMHG는 꾸준히 체중이 증가하는 것으로 보아 체중 감소 억제 효과가 MFG에서보다 OMHG에서 보다 유효한 효과에 대한 가능성이 있을 수도 있음을 추측 해본다.
- 그러므로 염증상 장질환 유발 후 CG보다 MFG와 OMHG에서 조직병리학적으로 더 빠른 회복의 결과를 관찰할 수 있었다
- 2. 대장길이는 정상군에 비해 대조군는 약 16% 로 감소한 반면 오매 투여군와 오매환 투여군은 정상군의 99% 수준으로 회복되었다.
- 연구결과 MF보다 OMH가 체중 및 RBC 수의 회복 등 건강개선에 더욱 효과적임을 알 수 있었다.
- 염증성 장질환의 치료에 MF와 OMH 모두 효과적임을 알 수 있었으나 두 제재 사이의 염증관련 부분에서는 뚜렷한 차이는 알 수 없었다
- 이러한 연구를 시행한 결과 DSS로 염증성 장질환이 유발된 흰 쥐에서 MF와 OMH 모두 체중감소 완화, 대장길이 회복, TNF-α와 WBC 수의 감소, 조직학적 회복을 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다
- 5. 조직학적으로 대조군에서는 혈변 및 대장 점막 조직의 훼손이 현저하게 관찰되었으나 오매 투여군과 오매환 투여군은 대부분 정상 수준으로 회복되었다.
- 1. 체중은 정상군에 비하여 실험군들의 증가속도는 완만해지고, 대조군와 오매 투여군는 6일차를 기점으로 감소하였으나, 오매환 투여군는 꾸준히 증가하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았다.
후속연구
- 또한 기타 다른 단독제재 및 복합제재, 더 나아가 sulfasalazine, mesalazine 등 양성 대조군 약물들과의 추가 비교 연구도 필요하리라 사료된다.
- 49 M/uL)에 비교하여 높은 것을 확인할 수 있었다. 실험군의 수가 크지 않아 단정할 수는 없지만 OMH 구성약제들 중 當歸, 人參, 肉桂 등의 효과로 보이며 체중과 같은 양상을 보이고 있으므로 추가적 연구가 필요할 것으로 사료된다. 그 외의 Hb와, Plt 수에서는 유의한 결과를 얻지 못하였다.
- 그 외의 Hb와, Plt 수에서는 유의한 결과를 얻지 못하였다. 체중증가와 RBC의 수를 비추어 볼 때 OMHG가 MFG에 비해 건강개선에 효과적인지에 대한 추가 연구가 필요하다고 사료된다.
- 향후 두 제재 투약군의 회복속도 및 치료기전, 기타 다른 cytokine의 차이를 더욱 연구해야 할 것으로 보인다
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