Aspergillus nidulans에서 과대 발현 시 cycloheximide에 저항성을 나타내는 chxA 분리 및 분석 Isolation and functional analysis of chxA whose over-expression caused Cycloheximide resistancy in Aspergillus nidulans원문보기
Cycloheximide는 진핵세포 세포질 ribosomes에 tanslation을 억제하는 항생제이다. 진핵세포의 80S리보솜의 60S 서브유닛에 작용하여 펩티드 사슬 연장에서의 전이반응을 저해함으로써 단백질 생합성을 저해하며 리보솜에서의 tRNA유리를 저해하여 폴리솜을 축적한다. 본 연구에서는 사상성 진균인 Aspergillus nidulans를 대상으로 cycloheximide의 단백질 합성 억제 기작을 자세히 알아보고자 과대발현 시 Cycloheximide에 저항성을 나타내는 유전자를 분리, 분석하였다. A. nidulans A773 균주에 A. nidulans genomic DNA library 를 형질전환 하여 cycloheximide에 저항성을 나타내는 형질전환체를 선별하였다. 그 결과 cycloheximide에 저항성을 나타내는 형질 전환체 Tf.12 1개를 선별할 수 있었다. 형질 전환체에서 genomic DNA를 수확한 후에 E. coli에 형질 전환하여 분리한 library DNA를 다시 한 번 A773에 형질 전환하여 CHX에 저항성을 나타냄을 확인하였다. Vector primer set(PUCR, PUCH)를 이용하여 ...
Cycloheximide는 진핵세포 세포질 ribosomes에 tanslation을 억제하는 항생제이다. 진핵세포의 80S리보솜의 60S 서브유닛에 작용하여 펩티드 사슬 연장에서의 전이반응을 저해함으로써 단백질 생합성을 저해하며 리보솜에서의 tRNA유리를 저해하여 폴리솜을 축적한다. 본 연구에서는 사상성 진균인 Aspergillus nidulans를 대상으로 cycloheximide의 단백질 합성 억제 기작을 자세히 알아보고자 과대발현 시 Cycloheximide에 저항성을 나타내는 유전자를 분리, 분석하였다. A. nidulans A773 균주에 A. nidulans genomic DNA library 를 형질전환 하여 cycloheximide에 저항성을 나타내는 형질전환체를 선별하였다. 그 결과 cycloheximide에 저항성을 나타내는 형질 전환체 Tf.12 1개를 선별할 수 있었다. 형질 전환체에서 genomic DNA를 수확한 후에 E. coli에 형질 전환하여 분리한 library DNA를 다시 한 번 A773에 형질 전환하여 CHX에 저항성을 나타냄을 확인하였다. Vector primer set(PUCR, PUCH)를 이용하여 insert DNA의 염기서열을 결정한 뒤 blast search를 한 결과 insert size는 약 1797bp이고, Chromosome III번에 위치하고 있었으며, 한 개의 완전한 ORF인 AN4654를 포함하고 있었다. AN4654는 581개의 amino acid를 encoding하고 있으며, 1개의 intron을 포함하고 있었다. 그리고 NLS(Nuclear LocalizationSignal) 790a.a, 870a.a 부분에 2개를 가지고 있었다. AN4654가 과대발현 시 CHX에 저항성을 타나내는지를 조사하기 위하여 Nitrate에 의하여 유도 될 수 있는 niiA 프로모터를 이용하여 chxA단백질을 세포 내에서 과대발현을 유도하였다. 결과 cycloheximide에서 저항성을 보이는 transformants이 나타났으며 이들은 AN4654.가 Northern분석을 통해서 과대발현 되었음을 확인하였다. AN4654의 기능을 알아보기 위하여 chxA유전자가 제거된 null mutant를 제조하였다. Delition을 위한 DNA construct는 double-joint PCR(DJ-PCR)방법으로 제조하였고, Southern analysis, PCR 분석으로 확인하였다. △chxA은 cycloheximide배지에 매우 민감함을 나타냈다. Mutagen처리 시에도 민감성을 나타내는지를 확인하기 위하여 HU, KCN, MMS에서 관찰한 결과 Cyclohecimide와는 달리 야생주와 동일하게 자라는 것을 확인 할 수 있었다. localization을 보기위해서 A. nidulans GFP vector에 cloning하여 확인하였다. Threonine으로 유도되는 alcA프로모터를 이용하여 ChxA 단백질을 세포 내에서 과대발현을 유도하여 Northern 분석을 통해서 과대발현 된 phenotype을 확인하여 현미경으로 핵의 위치를 관찰하였다. AN4654는 핵보다는 단백질 합성이 일어나는 ER에 위치하는 것으로 보였다.
Cycloheximide는 진핵세포 세포질 ribosomes에 tanslation을 억제하는 항생제이다. 진핵세포의 80S리보솜의 60S 서브유닛에 작용하여 펩티드 사슬 연장에서의 전이반응을 저해함으로써 단백질 생합성을 저해하며 리보솜에서의 tRNA유리를 저해하여 폴리솜을 축적한다. 본 연구에서는 사상성 진균인 Aspergillus nidulans를 대상으로 cycloheximide의 단백질 합성 억제 기작을 자세히 알아보고자 과대발현 시 Cycloheximide에 저항성을 나타내는 유전자를 분리, 분석하였다. A. nidulans A773 균주에 A. nidulans genomic DNA library 를 형질전환 하여 cycloheximide에 저항성을 나타내는 형질전환체를 선별하였다. 그 결과 cycloheximide에 저항성을 나타내는 형질 전환체 Tf.12 1개를 선별할 수 있었다. 형질 전환체에서 genomic DNA를 수확한 후에 E. coli에 형질 전환하여 분리한 library DNA를 다시 한 번 A773에 형질 전환하여 CHX에 저항성을 나타냄을 확인하였다. Vector primer set(PUCR, PUCH)를 이용하여 insert DNA의 염기서열을 결정한 뒤 blast search를 한 결과 insert size는 약 1797bp이고, Chromosome III번에 위치하고 있었으며, 한 개의 완전한 ORF인 AN4654를 포함하고 있었다. AN4654는 581개의 amino acid를 encoding하고 있으며, 1개의 intron을 포함하고 있었다. 그리고 NLS(Nuclear Localization Signal) 790a.a, 870a.a 부분에 2개를 가지고 있었다. AN4654가 과대발현 시 CHX에 저항성을 타나내는지를 조사하기 위하여 Nitrate에 의하여 유도 될 수 있는 niiA 프로모터를 이용하여 chxA단백질을 세포 내에서 과대발현을 유도하였다. 결과 cycloheximide에서 저항성을 보이는 transformants이 나타났으며 이들은 AN4654.가 Northern분석을 통해서 과대발현 되었음을 확인하였다. AN4654의 기능을 알아보기 위하여 chxA유전자가 제거된 null mutant를 제조하였다. Delition을 위한 DNA construct는 double-joint PCR(DJ-PCR)방법으로 제조하였고, Southern analysis, PCR 분석으로 확인하였다. △chxA은 cycloheximide배지에 매우 민감함을 나타냈다. Mutagen처리 시에도 민감성을 나타내는지를 확인하기 위하여 HU, KCN, MMS에서 관찰한 결과 Cyclohecimide와는 달리 야생주와 동일하게 자라는 것을 확인 할 수 있었다. localization을 보기위해서 A. nidulans GFP vector에 cloning하여 확인하였다. Threonine으로 유도되는 alcA프로모터를 이용하여 ChxA 단백질을 세포 내에서 과대발현을 유도하여 Northern 분석을 통해서 과대발현 된 phenotype을 확인하여 현미경으로 핵의 위치를 관찰하였다. AN4654는 핵보다는 단백질 합성이 일어나는 ER에 위치하는 것으로 보였다.
Cycloheximide (CHX) is an antibiotic that inhibits translation on eukaryotic cytoplasmic ribosomes. However, detailed action mechanism of CHX has not been understood. Thus, we isolated genes whose over-expression caused CHX resistancy in A. nidulans. Genomic DNA library constructed in an AMA1 based ...
Cycloheximide (CHX) is an antibiotic that inhibits translation on eukaryotic cytoplasmic ribosomes. However, detailed action mechanism of CHX has not been understood. Thus, we isolated genes whose over-expression caused CHX resistancy in A. nidulans. Genomic DNA library constructed in an AMA1 based vector which replicated in cytoplasm instead of integration into the main chromosome was transformed to A773, a host strain. Transformants were selected on CM, then replicated into CM containing 5 mM CHX to isolate CHX-resistant colonies among transformants. Tf12 was selected as a CHX-resistant colony. The transformed gDNA was rescued by transformation into E. coli with genomic DNA purified in Tf12. The rescued single gDNA clone (#1) was re-transformed into A773 to demonstrate CHX-resistancy of transformants. Indeed, CHX-resistant transformants were reappeared in transformation of #1 DNA from Tf12. The inserted gDNA fragment within AMA1-vector was sequenced using a vector primer pairs. The determined DNA sequence made possible to localize the region in a specific chromosome III. By searching the A. nidulans gDNA sequence database, one full-length ORF, AN4654 was identified within the gDNA of #1 from TF12. To confirm that over-expression of the identified ORF caused CHX-resistancy in transformants, transformants with AN4654 cDNA under the nitrate inducible niiA promoter were selected and tested CHX-resistancy. Indeed, over-expression of AN4654 cDNA resulted in CHX-resistancy in transformants. So, we named an AN4654 ORF chxA. Sequencing analysis revealed that chxA ORF was 1.7Kb interrupted by 1 intron, encoding a putative polypeptide of 581 amino acids. The blastp search with ChxA did not show any amino acid sequence match except homologs among Aspergillus genus. We generated null mutant of chxA using a double-joint PCR (DJ-PCR) method and characterized its null phenotype. Disruption of chxA was confirmed by southern analysis, PCR, and northern analysis. △chxA mutants exhibited extreme CHX-sensitivity compared to wild-type. Since ChxA contains putative nuclear localization signal (NLS) sequences, ChxA-sGFP fusion protein was expressed and checked its localization in the cell. Localization of ChxA was not correlated to the nucleus stained with DAPI, indicating that ChxA is not a nuclear protein, although in some conditions nuclear translocation of ChxA might not be excluded. For the moment, ChxA seems to be located in ER. ChxA is certainly related to CHX action within the cell. However, more detailed studies will be required to understand the function of ChxA and the relationship to CHX.
Cycloheximide (CHX) is an antibiotic that inhibits translation on eukaryotic cytoplasmic ribosomes. However, detailed action mechanism of CHX has not been understood. Thus, we isolated genes whose over-expression caused CHX resistancy in A. nidulans. Genomic DNA library constructed in an AMA1 based vector which replicated in cytoplasm instead of integration into the main chromosome was transformed to A773, a host strain. Transformants were selected on CM, then replicated into CM containing 5 mM CHX to isolate CHX-resistant colonies among transformants. Tf12 was selected as a CHX-resistant colony. The transformed gDNA was rescued by transformation into E. coli with genomic DNA purified in Tf12. The rescued single gDNA clone (#1) was re-transformed into A773 to demonstrate CHX-resistancy of transformants. Indeed, CHX-resistant transformants were reappeared in transformation of #1 DNA from Tf12. The inserted gDNA fragment within AMA1-vector was sequenced using a vector primer pairs. The determined DNA sequence made possible to localize the region in a specific chromosome III. By searching the A. nidulans gDNA sequence database, one full-length ORF, AN4654 was identified within the gDNA of #1 from TF12. To confirm that over-expression of the identified ORF caused CHX-resistancy in transformants, transformants with AN4654 cDNA under the nitrate inducible niiA promoter were selected and tested CHX-resistancy. Indeed, over-expression of AN4654 cDNA resulted in CHX-resistancy in transformants. So, we named an AN4654 ORF chxA. Sequencing analysis revealed that chxA ORF was 1.7Kb interrupted by 1 intron, encoding a putative polypeptide of 581 amino acids. The blastp search with ChxA did not show any amino acid sequence match except homologs among Aspergillus genus. We generated null mutant of chxA using a double-joint PCR (DJ-PCR) method and characterized its null phenotype. Disruption of chxA was confirmed by southern analysis, PCR, and northern analysis. △chxA mutants exhibited extreme CHX-sensitivity compared to wild-type. Since ChxA contains putative nuclear localization signal (NLS) sequences, ChxA-sGFP fusion protein was expressed and checked its localization in the cell. Localization of ChxA was not correlated to the nucleus stained with DAPI, indicating that ChxA is not a nuclear protein, although in some conditions nuclear translocation of ChxA might not be excluded. For the moment, ChxA seems to be located in ER. ChxA is certainly related to CHX action within the cell. However, more detailed studies will be required to understand the function of ChxA and the relationship to CHX.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.