Development of Genetic Markers for B Mating Type Locus and Cap Color in Pleurotus eryngii : 큰느타리(새송이)버섯 (Pleurotus eryngii)의 교배형 B 및 갓색깔의 유전학적 표지개발원문보기
큰느타리(새송이)버섯은 불화합성 로커스로 A와 B를 가지는 4극성 이차자웅이주 담자균류이다. 이 버섯의 교배형 로커스와 교배형 특이 프라이머를 탐색하기 위하여 12개의 균주를 사용하여 16개의 A 로커스 대립유전자와 15개의 B 로커스 대립유전자를 결정하였다. 특이하게 KNR2312 균주에서는 A와 B 로커스에 두개씩의 대립유전자, A3, A4, B3, B4, 만 존재하는 것으로 밝혀졌다. B 로커스의 B3과 B4는 여러 계통에서 넓게 분포되어 있다. A3과 A4도 5개의 계통에서 공유되었다. ...
큰느타리(새송이)버섯은 불화합성 로커스로 A와 B를 가지는 4극성 이차자웅이주 담자균류이다. 이 버섯의 교배형 로커스와 교배형 특이 프라이머를 탐색하기 위하여 12개의 균주를 사용하여 16개의 A 로커스 대립유전자와 15개의 B 로커스 대립유전자를 결정하였다. 특이하게 KNR2312 균주에서는 A와 B 로커스에 두개씩의 대립유전자, A3, A4, B3, B4, 만 존재하는 것으로 밝혀졌다. B 로커스의 B3과 B4는 여러 계통에서 넓게 분포되어 있다. A3과 A4도 5개의 계통에서 공유되었다. SCAR 표지 13-22100은 RAPD 통하여 얻은 교배형 특이서열을 통하여 제작되었는데 B3의 로커스를 가지는 단포자에서 잘 작동하여 특이밴드를 형성한다. 13-22100의 프라이머 산물은 B3와 동일하게 분리되는데, 이는 육종연구에서 화합성 균주를 찾을 수 있는 가능성을 제시해준다. 특이산물은 큰느타리버섯에서만 생성되어서 표고버섯, 맛버섯, 만가닥버섯, 잣버섯, 양송이버섯, 팽이버섯 그리고 큰느타리버섯과 가까운 느타리버섯에서도 발견되지 않았다.
전체적인 교배형 로커스를 밝히기 위하여 8,850개로 구성된 게놈 포스미드 은행을 구축하였고, 탐색을 통하여 교배형 관련 유전자를 포함하는 cPE932-22와 cPE1462-8클론을 선발하였다. 이들 클론에 들어 있는 약 70 kb서열을 분석하여 데이터베이스를 통해 페로몬 리셉터와 페로몬 추정 유전자가 찾아내었다. 페로몬 리셉터가 4개 발견되었다. 페로몬 리셉터의 아미노산 서열은 N 말단의 300개 정도의 아미노산 서열은 같은 로커스뿐만 아니라 다른 종에서 분리한 리셉터의 아미노산서열에서도 높은 수준으로 보존되어 있었다. 이들 서열은 막을 지나는 도메인과 페로몬과의 결합 특이성을 부여하는 보존된 지역으로 추정된다. 페로몬 리셉터의 아미노산 길이는 pepr1의 경우 327개, pepr2는 420개, pepr3는 470, pepr4는 559개 이었다. 각 페로몬 리셉터는 N 말단의 보존된 부위에 290개에 달하는 STE3 슈퍼패밀리 서열을 가지고 있다. 유사성 분석에서 pepr1과 pepr2가 비슷한 그룹에 속하고 pepr3와 pepr4가 비슷한 그룹으로 사료되었다. 페로몬 추정 유전자가 리셉터유전자 주위에서 6개 발견되었다. 이들은 43-61개의 아미노산 잔기를 가지며, 4개는 CaaX서열을 가지고 2개는 C말단으로부터 4번째에 C만을 가진다. 이들은 막에서 고정자역할을 할 것으로 사료된다.
자연계에서 채취된 큰느타리버섯의 갓색은 갈적색에서 부터 부드러운 갈색, 밝은 베이지색부터 베이지색, 백색, 백색크림까지 다양한데 이것은 갓색이 연속변이라는 것을 암시하고, QTL에 의해 조절되는 강력한 증거로 생각된다. 이 연구에서 갓색의 유전양상을 밝히고, RAPD와 BSA를 통하여 갓색특이밴드를 탐색하여 갓색과 동일하게 분리되는 충실한 SCAR 표지를 디자인하고자 하였다. L 값이 57.6인 KNR2322를 실험에 사용하였다. 먼저 사전에 이형접합체 (heterozygote) 상태의 로커스를 동질접합체 (homozygote)로 만들기 위하여 KNR2322에서 유래된 단포자를 사용하여 자식 (selfing)을 실시하고 갓색을 기준으로 선발을 반복 실시하여 F4 세대 까지 전개하였다. 검은색 계통은 L값이 57.6에서 50.8로 11.8% 검어졌고, 흰색계통은 57.6에서 72.0으로 25% 희졌다. 흰색에서 더 많은 변화가 있었는데, 이 결과는 원래의 모계통이 검은쪽에 (57.6) 가까운 편이어서 검게 될 수 있는 여지가 적었다는 것으로 설명할 수 있다. 다음 교배에서는 검은색과 흰색의 상대적인 우열성 관계를 구명하기 위한 B × W F1의 자식과 역교배를 통한 검정교배를 실시하였다. B × W F1 교배계의 평균 L값은 56.9로 검은색계통이나 흰색 계통의 평균 L값, 혹은 두 그룹의 중간 값과는 차이가 있었다. 이것은 약 1/3 정도 검은색 계통쪽으로 치우친 값이다. 이들 결과는 갓색이 단일의 우성 로커스에 의해 조절되지 않고, 주로 검은 색에 관련된 몇몇 유전자들에 의해 조절된다는 것을 암시한다. B × W, F1과 흰색 계통의 단포자간의 검정교배에서 B × W, F1에서 검은색을 대표하는 계통과 중간값을 대표하는 1두개의 계통을 사용하였다. 두개의 계통을 이용한 BC1F1 교배계는 두개나 그 이상의 갓색을 기준으로 구별되는 그룹으로 나눠지지 않고 정규분포를 보였다. 두 계통의 자식에 의한 교배계 F2도 같은 결과를 보였다. 자식과 검정교배의 결과는 갓색은 우성이나 열성의 유전자에 의해 조절되지 않고 QTL의 조절에 가깝다는 것을 암시한다.
이러한 유전양상을 가지는 갓색을 신속하고 충실하게 검출해줄 표지를 개발하기 위하여 갓색을 기준으로 나눈 두 그룹 W, B 교배계를 RAPD와 BSA로 특이 표지를 탐색하였다. 150개의 무작위 프라이머를 사용하여 24개의 특이 밴드를 골라내어 클로닝과 서열분석을 하였다. 유전자은행을 통한 검색결과 갓색과 연관된 유전자를 가지는 클론은 없었다. 24개의 서열은 SCAR 표지로 전환하여 W × B (F1) 교배계에 적용하여 충실도를 검정하였다. 그 결과 하나의 SCAR 표지가 검은색 이핵균사에만 700 bp의 밴드를 증폭하였다.
큰느타리(새송이)버섯은 불화합성 로커스로 A와 B를 가지는 4극성 이차자웅이주 담자균류이다. 이 버섯의 교배형 로커스와 교배형 특이 프라이머를 탐색하기 위하여 12개의 균주를 사용하여 16개의 A 로커스 대립유전자와 15개의 B 로커스 대립유전자를 결정하였다. 특이하게 KNR2312 균주에서는 A와 B 로커스에 두개씩의 대립유전자, A3, A4, B3, B4, 만 존재하는 것으로 밝혀졌다. B 로커스의 B3과 B4는 여러 계통에서 넓게 분포되어 있다. A3과 A4도 5개의 계통에서 공유되었다. SCAR 표지 13-22100은 RAPD 통하여 얻은 교배형 특이서열을 통하여 제작되었는데 B3의 로커스를 가지는 단포자에서 잘 작동하여 특이밴드를 형성한다. 13-22100의 프라이머 산물은 B3와 동일하게 분리되는데, 이는 육종연구에서 화합성 균주를 찾을 수 있는 가능성을 제시해준다. 특이산물은 큰느타리버섯에서만 생성되어서 표고버섯, 맛버섯, 만가닥버섯, 잣버섯, 양송이버섯, 팽이버섯 그리고 큰느타리버섯과 가까운 느타리버섯에서도 발견되지 않았다.
전체적인 교배형 로커스를 밝히기 위하여 8,850개로 구성된 게놈 포스미드 은행을 구축하였고, 탐색을 통하여 교배형 관련 유전자를 포함하는 cPE932-22와 cPE1462-8클론을 선발하였다. 이들 클론에 들어 있는 약 70 kb서열을 분석하여 데이터베이스를 통해 페로몬 리셉터와 페로몬 추정 유전자가 찾아내었다. 페로몬 리셉터가 4개 발견되었다. 페로몬 리셉터의 아미노산 서열은 N 말단의 300개 정도의 아미노산 서열은 같은 로커스뿐만 아니라 다른 종에서 분리한 리셉터의 아미노산서열에서도 높은 수준으로 보존되어 있었다. 이들 서열은 막을 지나는 도메인과 페로몬과의 결합 특이성을 부여하는 보존된 지역으로 추정된다. 페로몬 리셉터의 아미노산 길이는 pepr1의 경우 327개, pepr2는 420개, pepr3는 470, pepr4는 559개 이었다. 각 페로몬 리셉터는 N 말단의 보존된 부위에 290개에 달하는 STE3 슈퍼패밀리 서열을 가지고 있다. 유사성 분석에서 pepr1과 pepr2가 비슷한 그룹에 속하고 pepr3와 pepr4가 비슷한 그룹으로 사료되었다. 페로몬 추정 유전자가 리셉터유전자 주위에서 6개 발견되었다. 이들은 43-61개의 아미노산 잔기를 가지며, 4개는 CaaX서열을 가지고 2개는 C말단으로부터 4번째에 C만을 가진다. 이들은 막에서 고정자역할을 할 것으로 사료된다.
자연계에서 채취된 큰느타리버섯의 갓색은 갈적색에서 부터 부드러운 갈색, 밝은 베이지색부터 베이지색, 백색, 백색크림까지 다양한데 이것은 갓색이 연속변이라는 것을 암시하고, QTL에 의해 조절되는 강력한 증거로 생각된다. 이 연구에서 갓색의 유전양상을 밝히고, RAPD와 BSA를 통하여 갓색특이밴드를 탐색하여 갓색과 동일하게 분리되는 충실한 SCAR 표지를 디자인하고자 하였다. L 값이 57.6인 KNR2322를 실험에 사용하였다. 먼저 사전에 이형접합체 (heterozygote) 상태의 로커스를 동질접합체 (homozygote)로 만들기 위하여 KNR2322에서 유래된 단포자를 사용하여 자식 (selfing)을 실시하고 갓색을 기준으로 선발을 반복 실시하여 F4 세대 까지 전개하였다. 검은색 계통은 L값이 57.6에서 50.8로 11.8% 검어졌고, 흰색계통은 57.6에서 72.0으로 25% 희졌다. 흰색에서 더 많은 변화가 있었는데, 이 결과는 원래의 모계통이 검은쪽에 (57.6) 가까운 편이어서 검게 될 수 있는 여지가 적었다는 것으로 설명할 수 있다. 다음 교배에서는 검은색과 흰색의 상대적인 우열성 관계를 구명하기 위한 B × W F1의 자식과 역교배를 통한 검정교배를 실시하였다. B × W F1 교배계의 평균 L값은 56.9로 검은색계통이나 흰색 계통의 평균 L값, 혹은 두 그룹의 중간 값과는 차이가 있었다. 이것은 약 1/3 정도 검은색 계통쪽으로 치우친 값이다. 이들 결과는 갓색이 단일의 우성 로커스에 의해 조절되지 않고, 주로 검은 색에 관련된 몇몇 유전자들에 의해 조절된다는 것을 암시한다. B × W, F1과 흰색 계통의 단포자간의 검정교배에서 B × W, F1에서 검은색을 대표하는 계통과 중간값을 대표하는 1두개의 계통을 사용하였다. 두개의 계통을 이용한 BC1F1 교배계는 두개나 그 이상의 갓색을 기준으로 구별되는 그룹으로 나눠지지 않고 정규분포를 보였다. 두 계통의 자식에 의한 교배계 F2도 같은 결과를 보였다. 자식과 검정교배의 결과는 갓색은 우성이나 열성의 유전자에 의해 조절되지 않고 QTL의 조절에 가깝다는 것을 암시한다.
이러한 유전양상을 가지는 갓색을 신속하고 충실하게 검출해줄 표지를 개발하기 위하여 갓색을 기준으로 나눈 두 그룹 W, B 교배계를 RAPD와 BSA로 특이 표지를 탐색하였다. 150개의 무작위 프라이머를 사용하여 24개의 특이 밴드를 골라내어 클로닝과 서열분석을 하였다. 유전자은행을 통한 검색결과 갓색과 연관된 유전자를 가지는 클론은 없었다. 24개의 서열은 SCAR 표지로 전환하여 W × B (F1) 교배계에 적용하여 충실도를 검정하였다. 그 결과 하나의 SCAR 표지가 검은색 이핵균사에만 700 bp의 밴드를 증폭하였다.
Pleurotus eryngii is a bifactorial heterothallic basidiomycetes, containing A and B loci as incompatibility factor. In order to characterize the mating-type locus and screen the mating-type specific markers, total 16 alleles in A locus and 15 alleles in B locus from 12 P. eryngii strains were determ...
Pleurotus eryngii is a bifactorial heterothallic basidiomycetes, containing A and B loci as incompatibility factor. In order to characterize the mating-type locus and screen the mating-type specific markers, total 16 alleles in A locus and 15 alleles in B locus from 12 P. eryngii strains were determined. Particularly, only two alleles in both A and B loci, namely A3 and A4 for A locus, and B3 and B4 for B locus were discovered in the strain KNR2312. The B locus two alleles were widely distributed among the various strains. The SCAR marker 13-22100, which was designed for the rapid identification of the mushroom mating-type on the basis of the mating-type specific sequences derived from RAPD analysis, worked well in the monokaryons bearing B3 locus. The PCR products of 13-22,100 primer were specifically co-segregated with B3 locus, indicating the applicability of the primer in the rapid screening of compatible combination in mushroom breeding process. The DNA bands amplified with the 13-22,100 primer were specific for P. eryngii. The primer did not yield any DNA band for other mushrooms including Lentinus edodes, Agrocybe aegerita, Lyopyllum ulmarium, Lentinus lepideus, Agaricus bisporus, Flammulina velutipes, Pholiota nameko, and closely related Pleurotus. ostreatus.
In order to elucidate an entire mating-type locus, genomic DNA library was constructed containing over 8,850 fosmid clones. Among them, 2 clones were selected by screening with PCR. The size of the insert sequences in the fosmid clones cPE932-22 and cPE1462-8 were 32,769 bp and 40,453 bp, respectively. The size of the assembled sequence was over 70 kb. The putative genes in the assembled sequence were identified using NCBI database. The B3 locus in P. eryngii turned out to contain four pheromone receptor genes. The N-terminal amino acid sequence of the receptors was highly conserved not only among the four receptors but also that from other genus. The N-terminal region conceivably confers receptor specificity and transmembrane motif. The four receptor were various in amino acid length, 327 aa for Pepr1, 420 aa for Pepr2, 470 aa for Pepr3, and 559 aa for Pepr4. Each receptor contains STE3 superfamily domain of 290 amino acids at the N-terminus. By the homology test, pepr1 and pepr2 was thought to belong to the same group, while pepr3 was related to pepr4. In addition, six putative pheromone genes were identified at the sides of the receptor genes. 4 fo 6 encoded polypeptides of 43-61 amino acids with cysteine residue at the 4th site from C-terminus as a part of CaaX motif, which may play anchoring role of the pheromone in the cell membrane. 2 remaining pheromone-like sequences did not have CaaX, but had C residue at the 4th site from C-terminus.
I tried to elucidate the heredity of the cap color along with the development of faithful SCAR marker co-segregated with the color using specific DNA bands made from RAPD and BSA analyses. The dikaryon KNR2322 bearing dark brown cap color, 57.6 in a lightness, was used for this study. Inbreeding of homozygotes was performed to F4 generations based on the cap color. In the black line, the color was changed from 57.6 to 50.8, 11.8% of parental dikaron, while from 57.6 to 72.0, 25% in the white line. This result indicates that the parental fruiting body is close to black line which retains little room for change to more black. Subsequently, inbreeding (selfing) and test cross (back-crossing) were performed with W×B F1's monokaryotic offspring in order to elucidate the heredity property of cap color. The mean of L of W×B F1 (56.9) was not fall into either the mean of the black line or that of the white line. F1 hybrids' cap color was biased and distributed at the 1/3 part from the mean of the black hybrids, suggesting that the cap color trait is not managed by single dominant gene, but governed by several genes mainly related to the black color. In the back-crossing between W×B F1 and white monokaryotic progeny, BC1F1 hybrids were not fall into two or more discrete classes. Rather, the cap color of hybrids were continuously distributed as a normal curve. The F2 hybrids derived from inbreeding of two groups were also continuously distributed. These results implied that cap color trait was not controlled by dominate or recessive genes, rather to be close to QTL. For development of reliable marker segregated with cap color, RAPD and BSA methods were performed with two discrete monokaryotic offspring of the black line and the white line. 24 specific bands were isolated in the screening using 150 random primers. 24 RAPD bands were converted to SCAR marker based on its sequences, and applied to W×B F1 hybrids. One SCAR marker was co-segregated with cap color in W×B hybrids. 700 bp band was appeared only at the black fruiting body. The cap color SCAR marker 11-4600 shown faithful results.
Pleurotus eryngii is a bifactorial heterothallic basidiomycetes, containing A and B loci as incompatibility factor. In order to characterize the mating-type locus and screen the mating-type specific markers, total 16 alleles in A locus and 15 alleles in B locus from 12 P. eryngii strains were determined. Particularly, only two alleles in both A and B loci, namely A3 and A4 for A locus, and B3 and B4 for B locus were discovered in the strain KNR2312. The B locus two alleles were widely distributed among the various strains. The SCAR marker 13-22100, which was designed for the rapid identification of the mushroom mating-type on the basis of the mating-type specific sequences derived from RAPD analysis, worked well in the monokaryons bearing B3 locus. The PCR products of 13-22,100 primer were specifically co-segregated with B3 locus, indicating the applicability of the primer in the rapid screening of compatible combination in mushroom breeding process. The DNA bands amplified with the 13-22,100 primer were specific for P. eryngii. The primer did not yield any DNA band for other mushrooms including Lentinus edodes, Agrocybe aegerita, Lyopyllum ulmarium, Lentinus lepideus, Agaricus bisporus, Flammulina velutipes, Pholiota nameko, and closely related Pleurotus. ostreatus.
In order to elucidate an entire mating-type locus, genomic DNA library was constructed containing over 8,850 fosmid clones. Among them, 2 clones were selected by screening with PCR. The size of the insert sequences in the fosmid clones cPE932-22 and cPE1462-8 were 32,769 bp and 40,453 bp, respectively. The size of the assembled sequence was over 70 kb. The putative genes in the assembled sequence were identified using NCBI database. The B3 locus in P. eryngii turned out to contain four pheromone receptor genes. The N-terminal amino acid sequence of the receptors was highly conserved not only among the four receptors but also that from other genus. The N-terminal region conceivably confers receptor specificity and transmembrane motif. The four receptor were various in amino acid length, 327 aa for Pepr1, 420 aa for Pepr2, 470 aa for Pepr3, and 559 aa for Pepr4. Each receptor contains STE3 superfamily domain of 290 amino acids at the N-terminus. By the homology test, pepr1 and pepr2 was thought to belong to the same group, while pepr3 was related to pepr4. In addition, six putative pheromone genes were identified at the sides of the receptor genes. 4 fo 6 encoded polypeptides of 43-61 amino acids with cysteine residue at the 4th site from C-terminus as a part of CaaX motif, which may play anchoring role of the pheromone in the cell membrane. 2 remaining pheromone-like sequences did not have CaaX, but had C residue at the 4th site from C-terminus.
I tried to elucidate the heredity of the cap color along with the development of faithful SCAR marker co-segregated with the color using specific DNA bands made from RAPD and BSA analyses. The dikaryon KNR2322 bearing dark brown cap color, 57.6 in a lightness, was used for this study. Inbreeding of homozygotes was performed to F4 generations based on the cap color. In the black line, the color was changed from 57.6 to 50.8, 11.8% of parental dikaron, while from 57.6 to 72.0, 25% in the white line. This result indicates that the parental fruiting body is close to black line which retains little room for change to more black. Subsequently, inbreeding (selfing) and test cross (back-crossing) were performed with W×B F1's monokaryotic offspring in order to elucidate the heredity property of cap color. The mean of L of W×B F1 (56.9) was not fall into either the mean of the black line or that of the white line. F1 hybrids' cap color was biased and distributed at the 1/3 part from the mean of the black hybrids, suggesting that the cap color trait is not managed by single dominant gene, but governed by several genes mainly related to the black color. In the back-crossing between W×B F1 and white monokaryotic progeny, BC1F1 hybrids were not fall into two or more discrete classes. Rather, the cap color of hybrids were continuously distributed as a normal curve. The F2 hybrids derived from inbreeding of two groups were also continuously distributed. These results implied that cap color trait was not controlled by dominate or recessive genes, rather to be close to QTL. For development of reliable marker segregated with cap color, RAPD and BSA methods were performed with two discrete monokaryotic offspring of the black line and the white line. 24 specific bands were isolated in the screening using 150 random primers. 24 RAPD bands were converted to SCAR marker based on its sequences, and applied to W×B F1 hybrids. One SCAR marker was co-segregated with cap color in W×B hybrids. 700 bp band was appeared only at the black fruiting body. The cap color SCAR marker 11-4600 shown faithful results.
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