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문제 정의
- 한편 새로운 품종을 요구하고 있는 버섯재배 농가와 소비자를 위해 저작감과 맛이 우수한 갈색팽이버섯에 대한 연구 (공 등, 2006)를 꾸준히 진행하고 있다. 본 연구는 수집된 갈색팽이버섯 균주를 대상으로 PCR-RAPD로 균주간 유연관계를 밝히고, 갈색계통 팽이균주의 생리적 특성 조사와 최적배지 선발을 통하여 갈색팽이버섯의 다양한 소비 확대를 기하고자 하였다.
제안 방법
- Column Test에 사용한 배지별로 혼합비율을 달리하여 850 mℓ 플라스틱병에 배지재료를 450∼500 g씩 각각 충진 후 121℃에서 90분간 고압멸균하였으며, 종균 접종은 톱밥 종균을 미리 준비하여 10∼15 g/병씩 접종 및 균배양 후 자실체의 생육을 조사하였다.
- Genomic DNA의 분리는 PDA에서 7∼10일간 자란 균사를 막자사발과 막자를 이용해 액체질소에서 고운가루가 될 때까지 마쇄한 후 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)의 방법에 따라 Genomic DNA를 순수 분리하였다.
- PCR 결과 얻어진 산물 10 μℓ를 1.5% agarose gel에서 100V로 2시간 40분 동안 전기영동 한 후 EtBr에서 3분간 염색후 증류수에서 30분 간 탈색시켜 U · V하에서 확인하였다.
- 5% agarose gel에서 100V로 2시간 40분 동안 전기영동 한 후 EtBr에서 3분간 염색후 증류수에서 30분 간 탈색시켜 U · V하에서 확인하였다. 각각의 Primer (OPAX7, OPAX14, OPAX19 : Operon)를 사용하여 증폭 된 PCR산물의 전기영동 사진을 Gel compar II program 을 사용해 pearson correlation방법으로 유연관계를 분석하였다 (공, 1997).
- 갈색팽이의 생리적 특성 조사를 위하여 시험 균주인 갈색 팽이버섯 7균주와 CBFM-003 (백색팽이)균주를 대조구로 총 8개의 균주를 계대배양용 배지인 PDA 배지를 멸균기에 121℃에 20분간 멸균 후 페트리디쉬 ( Ф 87mm)에 분주하여 각각의 균주를 지름 5mm 크기로 절단 접종후 배양기에 배양하고 7일후에 온도별로 10℃, 20℃, 25℃, 30℃에서 균사생장을 비교하였다. 또한 pH 별 균사생장 비교를 위하여 배양온도를 25 로 PDA 배지에 pH를 4.
- 0으로 배지를 제조하여 각각의 패트리디쉬에 분주하여 균주 접종후 7일후에 균사생장을 비교 조사하였다. 균사밀도는 CBFM-007 균주에 대하여 + 낮음, ++ 보통, +++ 높음 등으로 달관 조사하였으며, 각 균주별 색깔 변이 비교를 위해 균사의 색깔부터 자실체의 갓과 대의 색깔 등을 비교 조사하였다.
- 갈색팽이의 생리적 특성 조사를 위하여 시험 균주인 갈색 팽이버섯 7균주와 CBFM-003 (백색팽이)균주를 대조구로 총 8개의 균주를 계대배양용 배지인 PDA 배지를 멸균기에 121℃에 20분간 멸균 후 페트리디쉬 ( Ф 87mm)에 분주하여 각각의 균주를 지름 5mm 크기로 절단 접종후 배양기에 배양하고 7일후에 온도별로 10℃, 20℃, 25℃, 30℃에서 균사생장을 비교하였다. 또한 pH 별 균사생장 비교를 위하여 배양온도를 25 로 PDA 배지에 pH를 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0으로 차이를 두고 배양 7일후에 균사생장을 비교하였다. 수집 갈색팽이 균주의 최적배지 선발을 위하여 PDA, MCM (mushroom complete medium), MMM (mushroom minimal media), YM (yeast extract and malt extract medium), MEM (mushroom extract media), WA (Water agar) 배지를 사용하여 (표2), 배양 온도를 25℃, pH는 6.
- 병재배 시 주재료인 미송톱밥과 부재료인 쌀겨, 비트펄프, 면실박 등을 혼합비율에 따라 미송+쌀겨 (8:2), 미송+면실박 (8:2), 미송+비트펄프 (8:2), 미송+면실박+비트펄프 (7:2:1), 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2), 미송+면실박+ 비트펄프 (5:3:2)로 6처리를 시험관 30 Ф × 200 mm 사용하여 25±1의 배양조건과 수분함량은 65±1%로 균사 밀도와 균사생장을 접종 20일후에 조사하였다.
- 분리된 DNA는 1% agarose gel에 50V로 1시간 전기영동한 후 EtBr (Ethidium Bromide)로 3분간 염색 후 증류수에서 30분간 탈색시켜 U·V하에서 확인하였다.
- 0으로 차이를 두고 배양 7일후에 균사생장을 비교하였다. 수집 갈색팽이 균주의 최적배지 선발을 위하여 PDA, MCM (mushroom complete medium), MMM (mushroom minimal media), YM (yeast extract and malt extract medium), MEM (mushroom extract media), WA (Water agar) 배지를 사용하여 (표2), 배양 온도를 25℃, pH는 6.0으로 배지를 제조하여 각각의 패트리디쉬에 분주하여 균주 접종후 7일후에 균사생장을 비교 조사하였다. 균사밀도는 CBFM-007 균주에 대하여 + 낮음, ++ 보통, +++ 높음 등으로 달관 조사하였으며, 각 균주별 색깔 변이 비교를 위해 균사의 색깔부터 자실체의 갓과 대의 색깔 등을 비교 조사하였다.
- 순수 분리된 DNA 100 ng에 10X buffer 5 μℓ, dNTPs (10 mM) 1 μℓ, primer (10 uM) 5 μℓ, Taq DNA polymerase (Takara) 0.5μℓ를 첨가한 후 멸균수로 최종 양을 50μℓ로 맞추었다.
- 이렇게 만들어진 혼합물을 thermocycler (Perkin Elmer GeneAmp PCR system 2400)을 사용해 94℃에서 5분간 최초 변성시킨 후 94℃ 1분, 35℃ 1분, 72℃ 2분 조건으로 40번 반복하여 PCR을 수행하였다.
대상 데이터
- 갈색팽이버섯 균주들의 유연관계 분석을 위하여 본 실험에 사용한 균주는 15개로 각 균주들의 수집 내역은 표 1에 요약하였다. 그 중에서 갈색팽이버섯 8개 균주는 농업과학 기술원 응용미생물과에서 분양받았다.
- 갈색팽이버섯 균주들의 유연관계 분석을 위하여 본 실험에 사용한 균주는 15개로 각 균주들의 수집 내역은 표 1에 요약하였다. 그 중에서 갈색팽이버섯 8개 균주는 농업과학 기술원 응용미생물과에서 분양받았다. 분자생물학적 유연관계 분석을 위한 대조균주로 CBFM-003 백색균주와 충 북농업기술원에서 보유하고 있는 7개 균주를 포함하여 총 15개 균주를 사용하였다.
- 그 중에서 갈색팽이버섯 8개 균주는 농업과학 기술원 응용미생물과에서 분양받았다. 분자생물학적 유연관계 분석을 위한 대조균주로 CBFM-003 백색균주와 충 북농업기술원에서 보유하고 있는 7개 균주를 포함하여 총 15개 균주를 사용하였다. 수집된 균주는 Potato Dextrose Agar (PDA, Difco) 배지를 사용하여 25±1℃의 항온조건에서 배양한 후, 4℃에서 보관하며 시험에 사용하였다.
- 수집된 균주는 Potato Dextrose Agar (PDA, Difco) 배지를 사용하여 25±1℃의 항온조건에서 배양한 후, 4℃에서 보관하며 시험에 사용하였다.
이론/모형
- 선발된 갈색팽이 CBFM-007균주와 백색팽이 CBFM-003균주 (대조구)의 배지재료들의 이화학적 특성조사를 위해 T-N은 Kjeldahl 분석법과 P2O5, K2O, CaO, MgO은 식물체 분석법을 실시하였다 (농촌진흥청, 1998). 병재배 시 주재료인 미송톱밥과 부재료인 쌀겨, 비트펄프, 면실박 등을 혼합비율에 따라 미송+쌀겨 (8:2), 미송+면실박 (8:2), 미송+비트펄프 (8:2), 미송+면실박+비트펄프 (7:2:1), 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2), 미송+면실박+ 비트펄프 (5:3:2)로 6처리를 시험관 30 Ф × 200 mm 사용하여 25±1의 배양조건과 수분함량은 65±1%로 균사 밀도와 균사생장을 접종 20일후에 조사하였다.
성능/효과
- 4 mm로 가장 좋았고, CBFM-002균주는 MCM배지를 제외하고 전반적으로 균사생장이 저조하였다. CBFM- 007균주의 균사밀도는 WA 배지를 제외한 모든 배지에서 균사밀도가 높은 것을 알 수 있었다. 일반적으로 버들송이는 균사생장시 glucose, peptone 배지가 적합하며, 최적배지는 버섯종류에 따라 다르고 팽이버섯균의 균사생장은 MCM 배지에서 가장 생장이 양호하다고 알려져 있다(박 · 이.
- pH를 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0으로 차이를 두고 배양 7일후에 균사생장을 비교한 결과 CBFM-002 균주를 제외한 대부분의 균주가 pH 6.0∼7.0범위에서 균사생장이 좋았으며, CBFM-003균주와 CBFM-008균주는 pH에 따른 큰 차이가 없었다.
- 각 균주별 색깔 변이 비교를 위해 균총의 색깔은 페트리디쉬에서 자실체의 갓과 대의 색깔 등은 850 mℓ 병재배 후 색을 달관 조사한 결과 CBFM-003 백색팽이 균주는 균사, 갓, 대 모두 흰색이었으나, CBPM-007 균주는 균사의 색깔은 연노랑에서 자실체의 갓, 대 모두 연갈색으로 나타났다. 그러나 CBPM-008에서와 같이 균총의 색이 백색이어도 자실체의 색은 모두 갈색으로 나타나 균총의 색과 자실체 색과는 연관이 없는 것으로 보인다.
- 각각의 Primer (OPAX7, OPAX14, OPAX19)를 사용하여 증폭된 PCR RAPD 분석결과 프라이머에 따라 다양한 DNA 다형성을 나타내었으며, OPAX7를 사용하였을 때는 4∼6개의 밴드를 얻을 수 있었지만, OPAX14를 사용했을 때는 밴드가 7∼9개씩 나타났으며 갈색팽이 균주의 유전적 계통도를 보면 85% 수준에서 5개의 그룹으로 나타났다.
- 갈색 팽이균주간의 유전적 특성을 보기 위하여 RAPD를 수행하여 유전적 계통도를 본 결과 85% 수준에서 5개의 그룹으로 구분되었다. 생리적 특성으로는 최적 온도는 25℃이고, CBFM-002를 제외한 모든 균주가 pH 6.
- 갈색팽이 CBFM-007균주와 백색팽이 CBFM-003균주의 배지재료들의 이화학적 특성조사를 위해 T-N은 Kjeldahl 분석법과 P2O5, K2O, CaO, MgO은 식물체 분석법으로 조사한 결과 T-N은 미송+면실박+비트펄프 6:2:2 처리가 1.04%로 가장 많았고, pH는 5.6정도였으며, P2O2, K2O, MgO는 대조구인 미송+쌀겨=8:2 처리의 배지에 가장 많이 함유되어 있었다.
- 균총과 자실체 간의 색깔 간에는 일정한 경향을 찾을 수 없었다. 갈색팽이 버섯 재배에 적당한 배지 재료를 선발하기 위하여 검토한 결과, 배지별 이화학적 성분 분석에서 T-N은 미송+면실 박+비트펄프 (6:2:2)가 가장 많았고, P2O2, K2O, MgO는 미송+쌀겨(8:2)배지에서 가장 많이 함유되어 있었다. 배지혼용 처리에 따른 균사생장 정도는 CBFM-003, CBFM-007균주 모두 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2) 배지에서 균사생장이 빠르고 균사밀도가 높았다.
- 갈색팽이버섯 균주를 온도별로 10℃, 20℃, 25℃, 30℃에서 균사생장을 비교한 결과 10℃처리구에서는 8개 균주 모두 균사생장이 18 mm∼36 mm로 생육이 저조하였으나 20℃처리구와 25℃에서는 균사생장이 양호하였으며, 30℃에서는 10℃처리보다 균사생장이 좋았으나 20℃, 25℃처리보다는 균사생장이 저조한 경향을 보였다.
- 균사생장은 MCM 배지에서 68.4∼83.4 mm로 가장 좋았고 균사밀도는 WA배지를 제외한 모든 배지에서 균사밀도가 높았다.
- 8 g으로 각각 높은 수량을 보였다. 따라서 백색팽이와 갈색팽이 모두 병재배에서는 미송+면실 박+비트펄프 (6:2:2)가 다른 혼합배지보다 가장 우수하였다. 배지수분함량을 65±1%로 조정한 병재배에서 생육환경 조건을 비교하기 위하여 14℃에서 발이시킨 후 4℃로 조절하여 자실체 생육을 고르게 조절한 뒤 생육온도를 7℃와 10℃로 나누어 생육온도에 따른 수량성을 비교한 결과, 7℃는 10℃보다 약간 높은 수량을 보였으나, 발이기간 동안 에너지 투입량 등 경제성을 고려하면 CBFM-007균주는 발이온도 10℃가 적합한 것으로 판단되었다.
- 배지수분함량을 65±1%로 조정한 병재배에서 생육환경 조건을 비교하기 위하여 14℃에서 발이시킨 후 4℃로 조절하여 자실체 생육을 고르게 조절한 뒤 생육온도를 7℃와 10℃로 나누어 생육온도에 따른 수량성을 비교한 결과, 7℃는 10℃보다 약간 높은 수량을 보였으나, 발이기간 동안 에너지 투입량 등 경제성을 고려하면 CBFM-007균주는 발이온도 10℃가 적합한 것으로 판단되었다.
- 갈색팽이버섯의 배지재료 선발을 위하여 배지재료별 자실체의 생육 및 수량을 조사한 결과는 표 9, 표 10과 같다. 배지재료별 특성비교에서 CBFM-003, CBFM-007 균주는 모든 배지에서 갓 직경, 대 직경, 대길이 등이 큰 차이 없이 비슷한 경향을 보였다. 그리고 배지 혼합비율에 따른 자실체의 생육은 균 배양일수는 25∼27일로 큰 차이가 없었으며, 초발이일수도 비슷한 경향을 나타내었다.
- 갈색팽이 버섯 재배에 적당한 배지 재료를 선발하기 위하여 검토한 결과, 배지별 이화학적 성분 분석에서 T-N은 미송+면실 박+비트펄프 (6:2:2)가 가장 많았고, P2O2, K2O, MgO는 미송+쌀겨(8:2)배지에서 가장 많이 함유되어 있었다. 배지혼용 처리에 따른 균사생장 정도는 CBFM-003, CBFM-007균주 모두 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2) 배지에서 균사생장이 빠르고 균사밀도가 높았다. 혼용된 배지로 병재배시 자실체의 갓 직경, 대 직경, 대 길이는 CBFM-003, CBFM-007 균주는 모든 배지에서 비슷한 경향을 보였다.
- 배지혼용 처리에 따른 균사생장 정도는 CBFM-003, CBFM-007균주 모두 미송+면실박+비트펄프 6:2:2 처리구에서 균사생장이 97.9∼98.4 mm로 다른 배지보다 빠르고 균사밀도도 매우 높게 나타났다.
- 혼용된 배지로 병재배시 자실체의 갓 직경, 대 직경, 대 길이는 CBFM-003, CBFM-007 균주는 모든 배지에서 비슷한 경향을 보였다. 병버섯 재배에서 배지 혼합비율에 따른 균 주간 균사 및 자실체의 생육은 미송+쌀겨 (8:2)보다 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2)배지에서 CBFM-003은 156.3 g, CBFM-007은 162.8 g으로 가장 좋은 수량을 보였다. 병재배에서 생육온도에 따른 수량은 7℃에서 약간 높은 수량을 보였으나, 발이기간 동안 에너지 투입량 등 경제성을 고려하면 CBFM-007은 발이온도 10℃가 적합한 것으로 판단되었다.
- 8 g으로 가장 좋은 수량을 보였다. 병재배에서 생육온도에 따른 수량은 7℃에서 약간 높은 수량을 보였으나, 발이기간 동안 에너지 투입량 등 경제성을 고려하면 CBFM-007은 발이온도 10℃가 적합한 것으로 판단되었다.
- 생리적 특성으로는 최적 온도는 25℃이고, CBFM-002를 제외한 모든 균주가 pH 6.0∼7.0 범위에서 균사 생장이 양호하였다.
- 그리고 배지 혼합비율에 따른 자실체의 생육은 균 배양일수는 25∼27일로 큰 차이가 없었으며, 초발이일수도 비슷한 경향을 나타내었다. 수량면에서 대조구인 미송+쌀겨 (8:2) 처리구보다 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2) 배지에서 CBFM-003은 156.3 g, CBFM-007은 162.8 g으로 각각 높은 수량을 보였다. 따라서 백색팽이와 갈색팽이 모두 병재배에서는 미송+면실 박+비트펄프 (6:2:2)가 다른 혼합배지보다 가장 우수하였다.
- 수집 갈색팽이 균주의 최적배지 선발을 위하여 PDA, MCM, MMM, YM, MEM, WA배지에서 배양온도를 25, pH는 6.0으로 배지를 제조하여 균주 접종후 7일후에 균사 생장을 비교 조사한 결과 MCM배지에서 균사생장이 68.4 ∼ 83.4 mm로 가장 좋았고, CBFM-002균주는 MCM배지를 제외하고 전반적으로 균사생장이 저조하였다.
- 갈색팽이버섯 균주를 온도별로 10℃, 20℃, 25℃, 30℃에서 균사생장을 비교한 결과 10℃처리구에서는 8개 균주 모두 균사생장이 18 mm∼36 mm로 생육이 저조하였으나 20℃처리구와 25℃에서는 균사생장이 양호하였으며, 30℃에서는 10℃처리보다 균사생장이 좋았으나 20℃, 25℃처리보다는 균사생장이 저조한 경향을 보였다. 이 결과로 볼 때 갈색 팽이버섯 균주의 균사생장을 위한 최적 온도는 25℃로 볼 수 있었다.
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