동해산 비단멍게(Halocynthia aurantium)의 체액세포들로부터 halocidin이라 명명된 새로운 항균 펩타이드를 정제하였다. Halocidin은 3,443 Da의 분자량을 지니며, 18개의 아미노산 잔기 (WNLALLHHGLNCAKGVLA, 18Hc)와 15개의 아미노산 잔기 (ALLHHGLNCAKGVLA, 15Hc)로 이루어진 다른 크기의 아단위들 (subunits)이 하나의 이황화 결합에 의해 연결된 이형-이량체 (hetero-dimer) 형태를 취하고 있었다. Halocidin의 cDNA는 RT-PCR과 5‘-RACE-PCR 기법을 조합하여 cloning되었다. 그 결과, halocidin은 10.37 kDa의 분자량을 지니는 pre-pro-펩타이드 형태로 이루어져 있다 는 것이 확인되었다. cDNA 구조와 활성형태(mature) ...
동해산 비단멍게(Halocynthia aurantium)의 체액세포들로부터 halocidin이라 명명된 새로운 항균 펩타이드를 정제하였다. Halocidin은 3,443 Da의 분자량을 지니며, 18개의 아미노산 잔기 (WNLALLHHGLNCAKGVLA, 18Hc)와 15개의 아미노산 잔기 (ALLHHGLNCAKGVLA, 15Hc)로 이루어진 다른 크기의 아단위들 (subunits)이 하나의 이황화 결합에 의해 연결된 이형-이량체 (hetero-dimer) 형태를 취하고 있었다. Halocidin의 cDNA는 RT-PCR과 5‘-RACE-PCR 기법을 조합하여 cloning되었다. 그 결과, halocidin은 10.37 kDa의 분자량을 지니는 pre-pro-펩타이드 형태로 이루어져 있다 는 것이 확인되었다. cDNA 구조와 활성형태(mature) 펩타이드의 알려진 아미노산 서열을 바탕으로, 전구체의 cDNA 서열에는 선도서열로 추정 되는 21개의 아미노산 잔기가 있고 뒤이어 halocidin의 큰 단량체(18Hc) 와 일치하는 활성형태의 펩타이드가 존재하며 그 뒤에 산성 잔기(6 Asp 와 5 Glu)가 많은 56개 아미노산 잔기의 C-말단 연장서열이 있는 것으 로 결론내렸다. Halocidin의 특성을 분석하기 위하여 크기가 다른 두 개 의 18Hc와 15Hc를 각각 합성하였고, 18Hc와 15Hc를 이량체 형태로 만 드는 과정에서 추가적인 펩타이드들(di-18Hc와 di-15Hc)이 만들어졌다. Halocidin 유도체들(18Hc, di-18Hc, 15Hc, di-15Hc와 합성 halocidin)의 항균활성을 비교한 실험에서 18Hc 유도체들은 내성균주인 메티실린 내 성 포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)과 다중약제내성 녹농균(multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa, MDRPA)에 대하여 15Hc 유도체들보다 더욱 강한 항균활성을 보유하고 있었다. 더욱 강력한 항균활성을 지닌 구조를 찾기 위해 18Hc 구조를 바탕으로 다양한 유도체들을 고안하여 합성하였다. 18Hc의 C-말단에서 잔기 하나씩 차례로 절단한 펩타이드들(17Hc, 16Hc, 15Hc, 14Hc, 13Hc 그리 고 12Hc)과 18Hc의 His7과 His8을 Lys으로 치환한 펩타이드(18HcKK라 명명함)를 합성하였다. 또한 18Hc와 18HcKK의 N-말단에 Lys 잔기를 추가하여 K19Hc와 K19HcKK를 합성하였고, 합성된 모든 펩타이드들을 동형-이량체(homo-dimer) 형태로 만들었다. Halocdin 유도체들의 항균 활성을 확인한 실험에서, C-말단의 잔기를 절단한 halocidin 유도체들의 항균활성이 급격히 감소하였기 때문에 최대 활성을 유지하기 위해서는 18Hc의 전체 길이가 필요한 것을 알 수 있었다. 또한 실험된 모든 halocodin 유도체의 이량체 형태들은 각각의 단량체 형태들보다 강한 항 균활성을 지니고 있었다. 그 중에서 di-K19Hc는 모든 범위의 NaCl 및 MgCl₂ 농도와 실험된 모든 세균에 대해서 가장 낮은 MICs 값을 나타냈 다. Di-K19Hc가 항균활성 실험에서 가장 뛰어난 활성을 나타냈기 때문 에, 몇몇의 Aspergillus와 Candida를 포함한 대표적인 진균들에 대하여 di-K19Hc의 항진균활성을 실험하였다. 그 결과, di-K19Hc는 6개의 Candida albicans와 2개의 Aspergillus 균주들에 대하여 각각 4와 16 ㎍ /ml 이하의 MICs 값을 나타내었다. 더불어 C. albicans에 대한 di-K19Hc의 작용기작을 조사하였다. Binding assay와 colony count assay를 통하여 di-K19Hc가 진균 세포막 성분중의 하나인 β -1,3-glucan과 특이적 상호작용을 통해 진균 표면과 결합하여 빠르게 C. albicans를 죽인다는 것을 확인하였다. C. albicans에 di-K19Hc를 처리하 였을 때, di-K19Hc는 C. albicans에서 세포내 K^(+)을 밖으로 유출시키고 세포들 안으로 핵 염색 시약인 PI의 유입을 유도했다. 추가로 di-K19Hc 가 처리된 C. albicans를 공초점 레이저 주사현미경과 주사 전자 현미경으로 관찰하였다. 이러한 결과들을 통하여 di-K19Hc가 C. albicans의 막 에 이온 채널을 형성하여 세포를 죽인다는 것을 증명하였다. 약물역동실험 및 동물실험에서 di-K19Hc는 사람 혈청 내에서 침전 되었고 사람 혈청 단백질들과 결합하였기 때문에 다른 halocidin 유도체 인 Khal(15Hc+K19Hc)을 고안하여 실험을 수행하였다. 그 결과, Khal의 항균활성은 di-K19Hc보다 약하지만, 혈청 내에서 매우 안정하였고 혈청 단백질들과의 결합 활성을 분석한 실험에서도 그동안 합성된 여러 형태 의 halocidin 유도체들(di-K19Hc, K19Hc 등)과는 달리 혈청 단백질들에 대한 결합 활성이 전혀 없는 것으로 확인되었다. 이후 진행된 동물 실험 에서 Khal은 특히 Listeria monocytogenes에 대해서 매우 강력한 치료 효과를 나타내었다. L. monocytogenes의 경우, 정맥 감염 직후 Khal을 바로 정맥 주사한 쥐는 90%의 생존율을 나타냈고, 2시간 후에 정맥 주 사한 경우에는 40%의 생존율을 나타냈으나 대조군인 PBS를 주사한 쥐 는 0%의 생존율을 나타냈다.
동해산 비단멍게(Halocynthia aurantium)의 체액세포들로부터 halocidin이라 명명된 새로운 항균 펩타이드를 정제하였다. Halocidin은 3,443 Da의 분자량을 지니며, 18개의 아미노산 잔기 (WNLALLHHGLNCAKGVLA, 18Hc)와 15개의 아미노산 잔기 (ALLHHGLNCAKGVLA, 15Hc)로 이루어진 다른 크기의 아단위들 (subunits)이 하나의 이황화 결합에 의해 연결된 이형-이량체 (hetero-dimer) 형태를 취하고 있었다. Halocidin의 cDNA는 RT-PCR과 5‘-RACE-PCR 기법을 조합하여 cloning되었다. 그 결과, halocidin은 10.37 kDa의 분자량을 지니는 pre-pro-펩타이드 형태로 이루어져 있다 는 것이 확인되었다. cDNA 구조와 활성형태(mature) 펩타이드의 알려진 아미노산 서열을 바탕으로, 전구체의 cDNA 서열에는 선도서열로 추정 되는 21개의 아미노산 잔기가 있고 뒤이어 halocidin의 큰 단량체(18Hc) 와 일치하는 활성형태의 펩타이드가 존재하며 그 뒤에 산성 잔기(6 Asp 와 5 Glu)가 많은 56개 아미노산 잔기의 C-말단 연장서열이 있는 것으 로 결론내렸다. Halocidin의 특성을 분석하기 위하여 크기가 다른 두 개 의 18Hc와 15Hc를 각각 합성하였고, 18Hc와 15Hc를 이량체 형태로 만 드는 과정에서 추가적인 펩타이드들(di-18Hc와 di-15Hc)이 만들어졌다. Halocidin 유도체들(18Hc, di-18Hc, 15Hc, di-15Hc와 합성 halocidin)의 항균활성을 비교한 실험에서 18Hc 유도체들은 내성균주인 메티실린 내 성 포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)과 다중약제내성 녹농균(multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa, MDRPA)에 대하여 15Hc 유도체들보다 더욱 강한 항균활성을 보유하고 있었다. 더욱 강력한 항균활성을 지닌 구조를 찾기 위해 18Hc 구조를 바탕으로 다양한 유도체들을 고안하여 합성하였다. 18Hc의 C-말단에서 잔기 하나씩 차례로 절단한 펩타이드들(17Hc, 16Hc, 15Hc, 14Hc, 13Hc 그리 고 12Hc)과 18Hc의 His7과 His8을 Lys으로 치환한 펩타이드(18HcKK라 명명함)를 합성하였다. 또한 18Hc와 18HcKK의 N-말단에 Lys 잔기를 추가하여 K19Hc와 K19HcKK를 합성하였고, 합성된 모든 펩타이드들을 동형-이량체(homo-dimer) 형태로 만들었다. Halocdin 유도체들의 항균 활성을 확인한 실험에서, C-말단의 잔기를 절단한 halocidin 유도체들의 항균활성이 급격히 감소하였기 때문에 최대 활성을 유지하기 위해서는 18Hc의 전체 길이가 필요한 것을 알 수 있었다. 또한 실험된 모든 halocodin 유도체의 이량체 형태들은 각각의 단량체 형태들보다 강한 항 균활성을 지니고 있었다. 그 중에서 di-K19Hc는 모든 범위의 NaCl 및 MgCl₂ 농도와 실험된 모든 세균에 대해서 가장 낮은 MICs 값을 나타냈 다. Di-K19Hc가 항균활성 실험에서 가장 뛰어난 활성을 나타냈기 때문 에, 몇몇의 Aspergillus와 Candida를 포함한 대표적인 진균들에 대하여 di-K19Hc의 항진균활성을 실험하였다. 그 결과, di-K19Hc는 6개의 Candida albicans와 2개의 Aspergillus 균주들에 대하여 각각 4와 16 ㎍ /ml 이하의 MICs 값을 나타내었다. 더불어 C. albicans에 대한 di-K19Hc의 작용기작을 조사하였다. Binding assay와 colony count assay를 통하여 di-K19Hc가 진균 세포막 성분중의 하나인 β -1,3-glucan과 특이적 상호작용을 통해 진균 표면과 결합하여 빠르게 C. albicans를 죽인다는 것을 확인하였다. C. albicans에 di-K19Hc를 처리하 였을 때, di-K19Hc는 C. albicans에서 세포내 K^(+)을 밖으로 유출시키고 세포들 안으로 핵 염색 시약인 PI의 유입을 유도했다. 추가로 di-K19Hc 가 처리된 C. albicans를 공초점 레이저 주사현미경과 주사 전자 현미경으로 관찰하였다. 이러한 결과들을 통하여 di-K19Hc가 C. albicans의 막 에 이온 채널을 형성하여 세포를 죽인다는 것을 증명하였다. 약물역동실험 및 동물실험에서 di-K19Hc는 사람 혈청 내에서 침전 되었고 사람 혈청 단백질들과 결합하였기 때문에 다른 halocidin 유도체 인 Khal(15Hc+K19Hc)을 고안하여 실험을 수행하였다. 그 결과, Khal의 항균활성은 di-K19Hc보다 약하지만, 혈청 내에서 매우 안정하였고 혈청 단백질들과의 결합 활성을 분석한 실험에서도 그동안 합성된 여러 형태 의 halocidin 유도체들(di-K19Hc, K19Hc 등)과는 달리 혈청 단백질들에 대한 결합 활성이 전혀 없는 것으로 확인되었다. 이후 진행된 동물 실험 에서 Khal은 특히 Listeria monocytogenes에 대해서 매우 강력한 치료 효과를 나타내었다. L. monocytogenes의 경우, 정맥 감염 직후 Khal을 바로 정맥 주사한 쥐는 90%의 생존율을 나타냈고, 2시간 후에 정맥 주 사한 경우에는 40%의 생존율을 나타냈으나 대조군인 PBS를 주사한 쥐 는 0%의 생존율을 나타냈다.
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