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문제 정의
- 멍게가 지닌 항균 peptide에 대한 연구는 불과 5년전 부터 시작되었는데, 분리된 peptide들은 구조와 항균활성에 있어 이제까지의 항균 peptide들과는 매우 다른 특징들을 가지고 있었다. 본 논문은 멍게의 체액세포에서 항균 peptide를 분리 . 정제하고 천연의 항균제재로서의 가능성에 대한 기초 자료를 만들고자한다.
- 본 논문은 멍게의 체액세포에서 항균 peptide를 분리 . 정제하고 천연의 항균제재로서의 가능성에 대한 기초 자료를 만들고자한다.
제안 방법
- 정제하였다. 46분 전후로 하여 단일 피크로 보이는 피크 3개를 Tricine SDS-PAGE하였다. 그 결과 그림 1에서 보듯이 6kDa이 하의 항균 펩타이드들이 발견되어졌다.
- 5% acetic acid 로서 산추출한 추출물을 GPC (Sephadex G-50) 컬럼, Preparative AU-PAGE, RP-HPLC를 이용하여 분리 . 정제하였다.
- Preparative AU-PAGE를 통해 얻은 fraction들을 5번 단위의 간격으로 overlay assay하여 항균활성을 확인하였다. 활성을 지닌 fraction들을 모아 Speed-Vac으로 농축하였다.
- 01% acetic acid에 용해시켰다, 4><106 colony forming unit (CFU)로 계산된 log-phase의 균주를 포함한 underlay agar에 일정한 간격으로 직경 3mm의 hole을 뚫은 후, 준비된 샘플 5成를 각 hole에 넣었다. underlay agar plate를 뒤집은 상태로 37℃에서 역시 뒤집은 상태로 overnight 배양하여, 균의 생장억제로 나타나는 clear zone의 크기로 항균활성의 정도를 확인하였다, 본 실험에서 clear zone의 직경(Hmm를 lusit에 해당하는 항균활성으로 정하였다.
- 활성을 지닌 fraction들을 모아 Speed-Vac으로 농축하였다. 농축된 샘플들을 HPLC system (Gilson 512)에 장착된 Cis Reversed-Phased Column (218TP54 Vydac Co. USA)을 통하여 용출시켰다.
- 본 연구에서 멍게 추출물을 분리 . 정제한 결과 항 균 펩타이드가 6 kDa 이하의 분자량을 가진 것으로 밝혀졌으며, specific activity를 보기 위해 100, 50, 30, 10kDa 규격으로 한외여과한 후, 여과액으로 활성을 확인한 결과 거의 비슷한 활성을 보였다, 그래서 WOkDa 이하 분자량을 가진 여과된 액의 항균효과 확인을 명확하게 확인해 본 결과 100kDa의 여과액 10-200ppm 농도의 멍게 부분 정제물에 대한 항균효과는 8종의 균에 대해 전반적으로 1S 정도의 수치를 감소시켰다.
- 살아있는 상태의 멍게를 70% 에탄올로써 표피를 세척한 후, 멍게의 출수구를 횡으로 절개하여 체액을 25mg EDTA가 담겨진 50ml 튜브에 직접 모았다. 이때 거즈 등을 이용하여 불순물은 여과시키도록 했다.
- 8M TrisX 사용하여 전기영동하였다. 전기영동한 gele Coomassie brilliant blue R-250으로 염색하였고, 염색된 gele Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma, USA) 으로 염색하고 탈색하여 확인하였다.
- 항균활성을 측정하려는 샘플들은 우선 AU-PAGE와 Radial diffusion을 접목시킨 실험방법인 overlay assay 를 통하여 단백질 band와 항균활성을 동시에 확인하였다.
- 활성 확인할 샘플을 Speed-Vac(Bioneer, Korea)으로 완전히 건조시키고 6以의 0.01% acetic acid에 용해시켰다, 4><106 colony forming unit (CFU)로 계산된 log-phase의 균주를 포함한 underlay agar에 일정한 간격으로 직경 3mm의 hole을 뚫은 후, 준비된 샘플 5成를 각 hole에 넣었다. underlay agar plate를 뒤집은 상태로 37℃에서 역시 뒤집은 상태로 overnight 배양하여, 균의 생장억제로 나타나는 clear zone의 크기로 항균활성의 정도를 확인하였다, 본 실험에서 clear zone의 직경(Hmm를 lusit에 해당하는 항균활성으로 정하였다.
- Preparative AU-PAGE를 통해 얻은 fraction들을 5번 단위의 간격으로 overlay assay하여 항균활성을 확인하였다. 활성을 지닌 fraction들을 모아 Speed-Vac으로 농축하였다. 농축된 샘플들을 HPLC system (Gilson 512)에 장착된 Cis Reversed-Phased Column (218TP54 Vydac Co.
대상 데이터
- 본 실험에서는 동해산 멍게(우렝쉥이, Halocynthia roretzi)는 23 阮을 사용하였으며 체액세포를 추출하기 위하여 생멍게를 사용하였다.
- 본 전기영동 Ee stacking gel°] 없는 12.5%의 continuous gel이 사용되었고 running buffer■로는 5% acetic acid가 사용되었다. 전기영동한 겔은 Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma, USA)으로 염색하고 탈색하여 확인하였다.
이론/모형
- Preparative AU-PAGE는 Harwig SSL et 기(1993)의 방법대로 수행되었고; flow rate는 60m]/hr로 하였으며, 2ml을 한 fraction으로 수거하였다.
- 본 실험에서는 단백질 정량은 Bicinchoninic acid (BCA) assay (Smith et al., 1985) 방법을 통하여 결정되었다.
성능/효과
- 100 kDa 한외여과막으로 분리된 여과액은 타 여 과막의 여과액과 비교하여 항균활성의 차이가 뚜렷히 나타나지는 않았지만 상대적 단백질량이 많아서 경제적인 부분에 도움이 될 것이라고 생각되었다. 그래서, colonical counting assay를 이용하여 100kDa의 여과액 10-200ppm 농도에서 8종의 식중독균에 대하여 확인해본 결과 IO, 의 균수를 감소 시켰다.
- In vitro상에서 100, 50, 30, 10 kDa 규격의 한외 여과막 튜브의 여과물과 비여과액의 항균력을 비교한 결과, 항균물질로 사료되는 100 kDa 이하의 물질들(여과액)에서 현저한 차이를 볼 수 있었다. 하지만, 각각의 여과액들의 항균활성은 거의 일정한 활성을 보였다.
- 100 kDa 한외여과막으로 분리된 여과액은 타 여 과막의 여과액과 비교하여 항균활성의 차이가 뚜렷히 나타나지는 않았지만 상대적 단백질량이 많아서 경제적인 부분에 도움이 될 것이라고 생각되었다. 그래서, colonical counting assay를 이용하여 100kDa의 여과액 10-200ppm 농도에서 8종의 식중독균에 대하여 확인해본 결과 IO, 의 균수를 감소 시켰다.(data not shown)
- 본 연구에서 멍게 추출물을 분리 . 정제한 결과 항 균 펩타이드가 6 kDa 이하의 분자량을 가진 것으로 밝혀졌으며, specific activity를 보기 위해 100, 50, 30, 10kDa 규격으로 한외여과한 후, 여과액으로 활성을 확인한 결과 거의 비슷한 활성을 보였다, 그래서 WOkDa 이하 분자량을 가진 여과된 액의 항균효과 확인을 명확하게 확인해 본 결과 100kDa의 여과액 10-200ppm 농도의 멍게 부분 정제물에 대한 항균효과는 8종의 균에 대해 전반적으로 1S 정도의 수치를 감소시켰다. 차후 항균제재로서의 가능성을 높이기 위해서 먼저 열에서의 안정성을 확인해 본 결과 100℃에서도 항균력의 차이가 없었다.
- 항균활성의 한외여과 여부, 열처리 여부에 대한 조추출물의 안정성을 보기 위하여 조 추출물 원액, 30kDa cut-off 여과액, 30kDa cut-off 비여과액, 100 ℃ 열처리된 조 추출액에 대한 항균활성을 Radial diffusion assay로 확인해 본 결과 비여과된 액과 조 추출물 원액보다 여과된 액에서 활성이 더 컸으며, 100C 열처리된 원액도 최초 원액과 활성의 차이가 없었다.(data not shown)
후속연구
- 차후 항균제재로서의 가능성을 높이기 위해서 먼저 열에서의 안정성을 확인해 본 결과 100℃에서도 항균력의 차이가 없었다. 차후 상용화 항균제재로서의 활용을 위해 기초 자료로서 물리화학적 안정성에 대한 결과들이 기대되는 바이다.
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