제주도에 자생하는 솔비나무(Maackia fauriei)로부터 시알산 결합 렉틴인 MFA(Maackia fauriei agglutinin)를 정제하였다. 정제한 MFA의 특성을 전기영동과 적혈구 응집 반응을 통하여 알아보았으며 형광현미경과 CCK assay를 이용하여 항암 타겟팅 작용의 ...
제주도에 자생하는 솔비나무(Maackia fauriei)로부터 시알산 결합 렉틴인 MFA(Maackia fauriei agglutinin)를 정제하였다. 정제한 MFA의 특성을 전기영동과 적혈구 응집 반응을 통하여 알아보았으며 형광현미경과 CCK assay를 이용하여 항암 타겟팅 작용의 스크리닝을 실시하였고 MFA의 polyclonal antibody를 정제하여 결과의 신뢰성을 높혔다. 또한 면역세포에 대한 활성에 대해서 알아보았으며 이를 토대로 MFA가 암세포 치료제 개발에 유용한 물질임을 확인하였다. MFA는 솔비나무 수피를 추출하고 여과하여 fetuin–argarose affinity column을 통하여 정제하였다. SDS-PAGE를 이용하여 정제한 렉틴의 분자량이 30kDa임을 확인하였으며 mouse의 적혈구 응집 반응을 이용하여 양성반응을 확인하였다. EDTA를 처리한 MFA를 이용하여 렉틴의 금속이온 의존성을 확인하였고 sialidase를 처리하여 시알산을 제거한 적혈구를 이용하여 MFA가 시알산에 특이적으로 결합하는 렉틴임을 알게 되었다. 사람 암세포인 유방암, 간암, 대장암 세포를 이용하여 암세포 표적성을 스크리닝 하였다. 형광 물질인 FITC를 직접 MFA에 결합시켜 암세포와 반응시켜 확인한 결과 표면에 부착하는 것을 확인하였고 CCK assay를 통하여 유방암세포에 가장 크게 특이성을 가지는 것으로 확인 하여 MFA가 유방암세포의 치료에 가장 유용하게 쓰일 수 있는 물질 이라는 것을 알게되었다. 시알산 가수분해효소를 이용하여 시알산을 제거한 유방암세포에는 MFA의 부착능과 독성이 모두 줄어듦을 확인하였고 특히 시알산 잔기 중 α-2,3-을 제거 하였을 때 독성이 가장 줄어드는 것으로 보아 α-2,3- 당쇄로 다른 당과 결합 하고 있는 시알산에 가장 특이적으로 결합함을 확인하였다. 렉틴과 암세포와의 결합 실험의 정확도를 높이기 위하여 렉틴의 polyclonal 항체를 정제하였다. rabbit에 항원을 주사하여 protein A affinity column을 이용하여 정제하였으며 SDS-PAGE로 항체의 분자량과 2-mercaptoethanol을 처리하여 heavy chain, light chain을 확인하였다. ELISA(Enzyme Linked Immuno-Solvent Assay)를 통하여 항원-항체반응이 농도 의존적으로 일어나는 것과 최적의 항체 농도를 알아보았고 형광현미경과 형광물질을 부착한 2차 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 직접 확인하였다. mouse의 비장에서 수집한 면역세포인 mouse splenocyte를 이용하여 동물면역세포에 대하여 MFA가 특정농도에서 세포증식에 도움을 주는 것을 확인 하였으며 이는 MFA가 면역학적으로도 유용한 물질임의 가능성을 확인하였다. 본 연구를 통해 항암제 연구에서 α-2,3-결합 시알산 타겟 물질로서 MCF-7과 같이 α-2,3- 시알산이 많이 발현되어 있는 암세포의 표적 마커로서 MFA의 개발 가능성을 제시하였고 향후 암세포 치료제 개발에 유용한 물질임을 확인하였다.
제주도에 자생하는 솔비나무(Maackia fauriei)로부터 시알산 결합 렉틴인 MFA(Maackia fauriei agglutinin)를 정제하였다. 정제한 MFA의 특성을 전기영동과 적혈구 응집 반응을 통하여 알아보았으며 형광현미경과 CCK assay를 이용하여 항암 타겟팅 작용의 스크리닝을 실시하였고 MFA의 polyclonal antibody를 정제하여 결과의 신뢰성을 높혔다. 또한 면역세포에 대한 활성에 대해서 알아보았으며 이를 토대로 MFA가 암세포 치료제 개발에 유용한 물질임을 확인하였다. MFA는 솔비나무 수피를 추출하고 여과하여 fetuin–argarose affinity column을 통하여 정제하였다. SDS-PAGE를 이용하여 정제한 렉틴의 분자량이 30kDa임을 확인하였으며 mouse의 적혈구 응집 반응을 이용하여 양성반응을 확인하였다. EDTA를 처리한 MFA를 이용하여 렉틴의 금속이온 의존성을 확인하였고 sialidase를 처리하여 시알산을 제거한 적혈구를 이용하여 MFA가 시알산에 특이적으로 결합하는 렉틴임을 알게 되었다. 사람 암세포인 유방암, 간암, 대장암 세포를 이용하여 암세포 표적성을 스크리닝 하였다. 형광 물질인 FITC를 직접 MFA에 결합시켜 암세포와 반응시켜 확인한 결과 표면에 부착하는 것을 확인하였고 CCK assay를 통하여 유방암세포에 가장 크게 특이성을 가지는 것으로 확인 하여 MFA가 유방암세포의 치료에 가장 유용하게 쓰일 수 있는 물질 이라는 것을 알게되었다. 시알산 가수분해효소를 이용하여 시알산을 제거한 유방암세포에는 MFA의 부착능과 독성이 모두 줄어듦을 확인하였고 특히 시알산 잔기 중 α-2,3-을 제거 하였을 때 독성이 가장 줄어드는 것으로 보아 α-2,3- 당쇄로 다른 당과 결합 하고 있는 시알산에 가장 특이적으로 결합함을 확인하였다. 렉틴과 암세포와의 결합 실험의 정확도를 높이기 위하여 렉틴의 polyclonal 항체를 정제하였다. rabbit에 항원을 주사하여 protein A affinity column을 이용하여 정제하였으며 SDS-PAGE로 항체의 분자량과 2-mercaptoethanol을 처리하여 heavy chain, light chain을 확인하였다. ELISA(Enzyme Linked Immuno-Solvent Assay)를 통하여 항원-항체반응이 농도 의존적으로 일어나는 것과 최적의 항체 농도를 알아보았고 형광현미경과 형광물질을 부착한 2차 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 직접 확인하였다. mouse의 비장에서 수집한 면역세포인 mouse splenocyte를 이용하여 동물면역세포에 대하여 MFA가 특정농도에서 세포증식에 도움을 주는 것을 확인 하였으며 이는 MFA가 면역학적으로도 유용한 물질임의 가능성을 확인하였다. 본 연구를 통해 항암제 연구에서 α-2,3-결합 시알산 타겟 물질로서 MCF-7과 같이 α-2,3- 시알산이 많이 발현되어 있는 암세포의 표적 마커로서 MFA의 개발 가능성을 제시하였고 향후 암세포 치료제 개발에 유용한 물질임을 확인하였다.
A lectin with specificity to sialic acids was purified from the bark of Maackia fauriei using column chromatography on fetuin-agarose. This lectin, designated Maackia fauriei agglutinin (MFA), is a tetramer protein with a molarcular mass of 30 kDa estimated by SDS-PAGE. The hemagglutination activity...
A lectin with specificity to sialic acids was purified from the bark of Maackia fauriei using column chromatography on fetuin-agarose. This lectin, designated Maackia fauriei agglutinin (MFA), is a tetramer protein with a molarcular mass of 30 kDa estimated by SDS-PAGE. The hemagglutination activity of MFA is mainly dependent on the sialic acids that were expressed surface of red blood cells. This activity was affected by demetalization with EDTA. MFA specifically recognizes the expression of α-2,3- linked sialic acids on the surface of MCF-7 (human breast cancer cells). MFA can induce phisiological effect by binding to α-2,3- linked sialic acids on the suface of cells. The results of CCK assays and detecting with fluorescence microscopy demonstrated that MFA had highly binding property to α-2,3- linked sialic acids on the suface of cells. CCK assays using human breast, liver, and colon cancer cells showed that MFA induces phisiological effect on cancer cells. Especially, the viability of MCF-7 is strongly reduced by MFA than the other cancer cells. Fluorescein microscopy indicated MFA probably adsorbed to cytosol and bind to nucleus. The binding of MFA to MCF-7 cells was detected by anti-MFA rabbit polyclonal antibody as well as FITC conjugated MFA to increase accuracy of data of binding site. In summary, the objective of this study was to investigate the binding property of MFA on human cancer cells. MFA had a specificity toward α-2,3- linked sialic acids on the surface of cells such as MCF-7. This binding property suggests that MFA is one of the potential of anti-tumor agents or target marker of breast cancer.
A lectin with specificity to sialic acids was purified from the bark of Maackia fauriei using column chromatography on fetuin-agarose. This lectin, designated Maackia fauriei agglutinin (MFA), is a tetramer protein with a molarcular mass of 30 kDa estimated by SDS-PAGE. The hemagglutination activity of MFA is mainly dependent on the sialic acids that were expressed surface of red blood cells. This activity was affected by demetalization with EDTA. MFA specifically recognizes the expression of α-2,3- linked sialic acids on the surface of MCF-7 (human breast cancer cells). MFA can induce phisiological effect by binding to α-2,3- linked sialic acids on the suface of cells. The results of CCK assays and detecting with fluorescence microscopy demonstrated that MFA had highly binding property to α-2,3- linked sialic acids on the suface of cells. CCK assays using human breast, liver, and colon cancer cells showed that MFA induces phisiological effect on cancer cells. Especially, the viability of MCF-7 is strongly reduced by MFA than the other cancer cells. Fluorescein microscopy indicated MFA probably adsorbed to cytosol and bind to nucleus. The binding of MFA to MCF-7 cells was detected by anti-MFA rabbit polyclonal antibody as well as FITC conjugated MFA to increase accuracy of data of binding site. In summary, the objective of this study was to investigate the binding property of MFA on human cancer cells. MFA had a specificity toward α-2,3- linked sialic acids on the surface of cells such as MCF-7. This binding property suggests that MFA is one of the potential of anti-tumor agents or target marker of breast cancer.
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