γ-aminobutyric acid (GABA)는 자연계에 널리 분포하는 비단백질성 아미노산으로서 사람의 신경계 또는 혈액에 함유되어 있으나, 대부분은 뇌의 골수에 존재하여 acetylcholine이라는 신경전달물질을 증가시키고 뇌기능을 촉진시키는 생리활성물질이다. 뇌 혈류개선, 산소공급 증가, 뇌세포 대사기능 촉진, 스트레스 해소, 혈압강하, 기억력증진, 우울증 완화, 뇌졸중 및 결장암·대장암 세포의 전이 및 증식 억제효과가 있는 것으로 밝혀지면서 이러한 효능을 목적으로 한 제품들의 개발이 이루어지고 있다. GABA는 식품소재로서 세계적으로 1980년대 중반부터 이용하기 시작하여 2001년경부터 본격적으로 시장을 형성하였으나, 우리나라에서는 단일 성분으로는 현재 건강기능식품에 사용할 수 없으므로 GABA 함유 제품들의 개발이 미진한 실정이다. 국내에서 사용되는 유산균 발효균주들도 일부를 제외하고는 선진국으로부터 수입되고 있어 GABA 생산능을 지닌 유산균주들의 개발이 필요하다. 한국의 전통 발효식품인 김치로부터 GABA 생산능력이 우수한 유산균주 ...
γ-aminobutyric acid (GABA)는 자연계에 널리 분포하는 비단백질성 아미노산으로서 사람의 신경계 또는 혈액에 함유되어 있으나, 대부분은 뇌의 골수에 존재하여 acetylcholine이라는 신경전달물질을 증가시키고 뇌기능을 촉진시키는 생리활성물질이다. 뇌 혈류개선, 산소공급 증가, 뇌세포 대사기능 촉진, 스트레스 해소, 혈압강하, 기억력증진, 우울증 완화, 뇌졸중 및 결장암·대장암 세포의 전이 및 증식 억제효과가 있는 것으로 밝혀지면서 이러한 효능을 목적으로 한 제품들의 개발이 이루어지고 있다. GABA는 식품소재로서 세계적으로 1980년대 중반부터 이용하기 시작하여 2001년경부터 본격적으로 시장을 형성하였으나, 우리나라에서는 단일 성분으로는 현재 건강기능식품에 사용할 수 없으므로 GABA 함유 제품들의 개발이 미진한 실정이다. 국내에서 사용되는 유산균 발효균주들도 일부를 제외하고는 선진국으로부터 수입되고 있어 GABA 생산능을 지닌 유산균주들의 개발이 필요하다. 한국의 전통 발효식품인 김치로부터 GABA 생산능력이 우수한 유산균주 Lactobacillus zymae GU240을 선발하였고, 균주의 GABA 생산능력을 측정하였다. 또한 이 균주가 포함하고 있는 glutamate decarboxylase gene (GAD) 을 대장균에서 과발현 시켰다. 대장균에서 발현된 GAD는 pH 4.5, 41℃에서 최대활성을 보였고, 조효소인 pyridoxal 5’-phosphate (PLP)에 의존적인 경향을 나타내었다. 정제된 glutamate decarboxylase (GAD)는 mono sodium glutamic acid (MSG)를 기질로 측정하였을 때, Km은 1.7 mM, Vmax는 0.01 mM/min으로 확인되었다. 대장균에서 특성을 조사한 GAD를 유산균에 도입하여 활성을 측정하고 나아가 GABA 생성능이 우수한 종균으로써 활용하기 위한 기초연구로 분자생물학적 연구나 유전공학적 방법을 포함하여 다양한 방법으로 종균을 개량하는 연구들이 필요하리라 생각되었다. 따라서 우리는 사람의 대변으로부터 분리한 Weissella cibaria 33의 cryptic plasmid인 pJY33을 분리하여 특성을 조사하였다. 염기서열 분석 결과 pJY33의 전체 DNA 길이는 2,365 bp로 이루어져 있으며, 2개의 open reading frame (ORF)와 direct repeat 7개, inverted repeat 7개를 가지고 있었다. ORF1은 134개의 아미노산을 가지며 Vibrio splendidus의 기능을 알 수 없는 단백질과 52% 상동성을 보였고, ORF2는 282 개의 아미노산을 가지며 W. cibaria KLC 140의 cryptic plasmid인 pKLCA의 복제단백질로 추정되는 단백질과 87% 상동성을 보였다. pJY33과 pBluescriptⅡ SK(-)를 연결하여 클로닝벡터의 기본골격인 pBSJY33을 제작하였다. 이에 selectable marker로 erythromycin resistance gene을 도입하여 크기가 약 6.5 kb인 pJY33E를 제작하였다. pJY33E는 single strand DNA가 검출되어 rolling circle type의 복제기작을 가지는 것으로 추정되었고, 이는 87%의 상동성을 보였던 pKLCA의 복제단백질과 동일한 복제기작을 가짐을 확인하였다. 또한 항생제가 없는 배지에서 1 주일 배양 후에도 약 86%의 안정성을 보여 항생제 첨가 없이도 일정기간 동안 Lactobacillus brevis에서 외래 유전자의 발현을 유도할 수 있을 것으로 기대된다. α-Galactosidase gene이 클로닝 되어있는 pJY33Eaga는 control인 pJY33E에 비하여 약 42배 높은 역가를 보였지만, gadB gene이 클로닝 되어있는 pJYgad에서는 control과 유의적인 차이를 확인할 수 없었음으로 이를 개선하기 위하여 promoter sequence를 연결하여 발현벡터로 개선이 필요할 것으로 생각된다. 본 연구에서 개발되어진 shuttle vector인 pJY33E에 사용된 항생제 내성 유전자의 사용으로 인해 식품에서의 직접적인 사용은 현재 불가능할 것으로 판단된다. 따라서 항생제 내성 유전자가 아닌 흔히 사용가능한 reporter gene을 이용하는 등의 식품용 마커의 개발, 선발하고 사용하는 연구가 벡터개발과 함께 계속 되어져야 된다고 사료된다.
γ-aminobutyric acid (GABA)는 자연계에 널리 분포하는 비단백질성 아미노산으로서 사람의 신경계 또는 혈액에 함유되어 있으나, 대부분은 뇌의 골수에 존재하여 acetylcholine이라는 신경전달물질을 증가시키고 뇌기능을 촉진시키는 생리활성물질이다. 뇌 혈류개선, 산소공급 증가, 뇌세포 대사기능 촉진, 스트레스 해소, 혈압강하, 기억력증진, 우울증 완화, 뇌졸중 및 결장암·대장암 세포의 전이 및 증식 억제효과가 있는 것으로 밝혀지면서 이러한 효능을 목적으로 한 제품들의 개발이 이루어지고 있다. GABA는 식품소재로서 세계적으로 1980년대 중반부터 이용하기 시작하여 2001년경부터 본격적으로 시장을 형성하였으나, 우리나라에서는 단일 성분으로는 현재 건강기능식품에 사용할 수 없으므로 GABA 함유 제품들의 개발이 미진한 실정이다. 국내에서 사용되는 유산균 발효균주들도 일부를 제외하고는 선진국으로부터 수입되고 있어 GABA 생산능을 지닌 유산균주들의 개발이 필요하다. 한국의 전통 발효식품인 김치로부터 GABA 생산능력이 우수한 유산균주 Lactobacillus zymae GU240을 선발하였고, 균주의 GABA 생산능력을 측정하였다. 또한 이 균주가 포함하고 있는 glutamate decarboxylase gene (GAD) 을 대장균에서 과발현 시켰다. 대장균에서 발현된 GAD는 pH 4.5, 41℃에서 최대활성을 보였고, 조효소인 pyridoxal 5’-phosphate (PLP)에 의존적인 경향을 나타내었다. 정제된 glutamate decarboxylase (GAD)는 mono sodium glutamic acid (MSG)를 기질로 측정하였을 때, Km은 1.7 mM, Vmax는 0.01 mM/min으로 확인되었다. 대장균에서 특성을 조사한 GAD를 유산균에 도입하여 활성을 측정하고 나아가 GABA 생성능이 우수한 종균으로써 활용하기 위한 기초연구로 분자생물학적 연구나 유전공학적 방법을 포함하여 다양한 방법으로 종균을 개량하는 연구들이 필요하리라 생각되었다. 따라서 우리는 사람의 대변으로부터 분리한 Weissella cibaria 33의 cryptic plasmid인 pJY33을 분리하여 특성을 조사하였다. 염기서열 분석 결과 pJY33의 전체 DNA 길이는 2,365 bp로 이루어져 있으며, 2개의 open reading frame (ORF)와 direct repeat 7개, inverted repeat 7개를 가지고 있었다. ORF1은 134개의 아미노산을 가지며 Vibrio splendidus의 기능을 알 수 없는 단백질과 52% 상동성을 보였고, ORF2는 282 개의 아미노산을 가지며 W. cibaria KLC 140의 cryptic plasmid인 pKLCA의 복제단백질로 추정되는 단백질과 87% 상동성을 보였다. pJY33과 pBluescriptⅡ SK(-)를 연결하여 클로닝벡터의 기본골격인 pBSJY33을 제작하였다. 이에 selectable marker로 erythromycin resistance gene을 도입하여 크기가 약 6.5 kb인 pJY33E를 제작하였다. pJY33E는 single strand DNA가 검출되어 rolling circle type의 복제기작을 가지는 것으로 추정되었고, 이는 87%의 상동성을 보였던 pKLCA의 복제단백질과 동일한 복제기작을 가짐을 확인하였다. 또한 항생제가 없는 배지에서 1 주일 배양 후에도 약 86%의 안정성을 보여 항생제 첨가 없이도 일정기간 동안 Lactobacillus brevis에서 외래 유전자의 발현을 유도할 수 있을 것으로 기대된다. α-Galactosidase gene이 클로닝 되어있는 pJY33Eaga는 control인 pJY33E에 비하여 약 42배 높은 역가를 보였지만, gadB gene이 클로닝 되어있는 pJYgad에서는 control과 유의적인 차이를 확인할 수 없었음으로 이를 개선하기 위하여 promoter sequence를 연결하여 발현벡터로 개선이 필요할 것으로 생각된다. 본 연구에서 개발되어진 shuttle vector인 pJY33E에 사용된 항생제 내성 유전자의 사용으로 인해 식품에서의 직접적인 사용은 현재 불가능할 것으로 판단된다. 따라서 항생제 내성 유전자가 아닌 흔히 사용가능한 reporter gene을 이용하는 등의 식품용 마커의 개발, 선발하고 사용하는 연구가 벡터개발과 함께 계속 되어져야 된다고 사료된다.
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