전염성 바이러스의 감염으로부터 방어하기 위한 가장 효과적인 방법은 백신접종을 통한 예방이다． 현재까지 개발되고 있는 바이러스 사백신은 화학물질 기반으로， 포르말린 혹은 베타－프로피오락톤을 처리하여 생산한다． 최근까지 포르말린－사백신은 성공적으로 개발되고 있고 산업적으로 대량 생산의 효율이 좋기 때문에 매우 경제적으로 사용되고 있다． 그러나，이러한 화학물질 기반 백신은 우리 몸에 남을 잔류량에 의한 잠재하는 부작용을 최소한으로 하는 정제단계가 필요하다. 또한 이전에 발표되었던 논문에서, 포르말린 기반 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV: respiratory syncytial virus）혹은 홍역 백신을 접종 받은 후에 바이러스에 감염될 경우 질병이 더욱 악화되는 사례가 보고되고 있다. 이러한 이유로， 백신을 제조 시 바이러스 불활화를 위해 사용하던 포르말린을 대체하는 안전성이 보장되는 새로운 방법이 필요하다. 이에 본 연구는 이러한 목적의 일환으로 새로운 형태의 바이러스 ...
전염성 바이러스의 감염으로부터 방어하기 위한 가장 효과적인 방법은 백신접종을 통한 예방이다． 현재까지 개발되고 있는 바이러스 사백신은 화학물질 기반으로， 포르말린 혹은 베타－프로피오락톤을 처리하여 생산한다． 최근까지 포르말린－사백신은 성공적으로 개발되고 있고 산업적으로 대량 생산의 효율이 좋기 때문에 매우 경제적으로 사용되고 있다． 그러나，이러한 화학물질 기반 백신은 우리 몸에 남을 잔류량에 의한 잠재하는 부작용을 최소한으로 하는 정제단계가 필요하다. 또한 이전에 발표되었던 논문에서, 포르말린 기반 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV: respiratory syncytial virus）혹은 홍역 백신을 접종 받은 후에 바이러스에 감염될 경우 질병이 더욱 악화되는 사례가 보고되고 있다. 이러한 이유로， 백신을 제조 시 바이러스 불활화를 위해 사용하던 포르말린을 대체하는 안전성이 보장되는 새로운 방법이 필요하다. 이에 본 연구는 이러한 목적의 일환으로 새로운 형태의 바이러스 불활성화 방법을 고안하고 이를 사백신 제작에 응용함으로써, 사백신 제작 기술의 확장을 목표로 삼았다. 녹차는 Camellia sinensis 식물에서 생산되며, 주요 카테킨은 에피갈로카테킨 (EGC: epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트 (ECG: epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG: epigallocatechin gallate) 및 에피키테킨 (EC: epicatechin)으로 이루어져있다． 녹차추출물의 가장 주요 카테킨인 EGCG는 우리 몸에 안전하고, 내성을 가지고 있으며, 항바이러스, 항산화, 항박테리아, 항암 등의 다양한 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 녹차 추출물을 인플루엔자 바이러스에 농도별로 처리하여 시간이 지남에 따라 바이러스의 감염성이 저해되는 것을 확인하였다． 또한, 인플루엔자 바이러스 단백질과 녹차 추출물을 반응시킨 후, 전기영동법을 통해 녹차 추출물이 결합되어 단백질의 분자량이 증가된 것을 확인하였다． EGCG를 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질에 처리하여 LCMS/MS를 분석한 결과, 디하이드로에피갈로카테킨 (Dygydroepigallocatechin) 형태로 변형되어 헤마글루티닌 단백질의 152번째 시스테인에 결합하여 51.9%의 변형을 일으킨 것을 확인할 수 있었고, 아주 적은 확률로 222번째 티로신과 319번째 시스테인에도 결합된 것을 확인하였다. 또한, 인플루엔자의 에피톱 펩타이드에 포름알데하이드와 EGCG를 처리하였을 때, EGCG에 의한 단백질 변형이 포름알데하이드에 비해 현저히 적은 것을 확인할 수 있었다. 그러므로, 녹차 처리에 의해 에피톱의 고정잔기(anchor residue)의 보존성이 다른 백신에도 적용될 수 있는지를 확인하기 위해, 직선의 에피톱의 아미노산 조성을 분석하였고, 인간 MHC molecule에 바인딩하기위한 각 아미노산의 중요성을 분석하였다. 20개의 아미노산 중, 시스테인 잔기는 에피톱에서 가장 드물게 나타났다. 시스테인이 EGCG에 의한 변형의 첫번째 타겟임을 고려하면, 불활화 제제로써 EGCG의 사용은 포르말린 기반 백신보다 더 뛰어난 항체생산을 할 수 있는 능력을 가진 백신을 만들 수 있다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과를 기반으로, 인플루엔자 바이러스 사백신을 제조하였고, 불활화백신으로 사용하기 위해 바이러스 증식을 비가역적으로 불활화하는지를 확인하였다. 유정란에서의 계대배양， 마우스에서의 비강접종， 글루타티온 （glutathione)과 아스코르브산 （ascorbic acid）이 존재하는 환원환경의 동물세포에서, 모두 바이러스의 감염성을 재현하는 것에 실패함으로써 비가역적으로 불화화됨을 확인하였다. 마우스를 이용한 동물모델에서, 녹차 독성 테스트를 통해 녹차기반 백신의 녹차 잔류가 미치는 해로운 영향이 없다는 안전성을 입증하였다. 또한，녹차 추출물을 사용하면， 화학물질기반 백신 생산 시 투석을 통한 잔류 화학물질 제거과정이 불필요 하여 경제적인 이점이 있다는 것을 알 수 있었다. 녹차 기반 사백신을 효능평가 결과， 매우 강한 면역원성을 보여주었으며, 특히 근육주사의 경우 포르말린 기반 사백신 보다 녹차 기반 사백신에서 높은 헤마글루티네이션 억제 항체와 중화항체를 유도한 것을 확인하였다. 이렇게 유도된 항체의 항원에 대한 친화성을 효소면역분석법 (ELISA)을 이용하여 확인한 결과, 항원-항체 결합에 다양한 농도의 요소로 세척해 주었을 때, 녹차 기반 사백신에서 더 강력한 유지능력을 지니는 것을 확인하였다. 또한, 녹차 처리시 발생하는 비공유결합의 연관성에 대해서도, endosome과 같은 환경인 산도 5.2의 버퍼로 항원-항체 결합을 세척해주었을 때, 녹차 처리 바이러스와 포르말린 처리 바이러스에 대한 항체값이 거의 동일하게 나타난 것을 확인하였다. 특히, 독성을 가진 야생형 바이러스의 대한 방어능력도 우수하여 치사율 이상의 공격접종에서도 완벽한 생존률을 나타내었고, 폐에서의 바이러스 증식도 효과적으로 저해하였음을 보여주었다. 결론적으로 본 연구를 통해 개발한 녹차 기반 인플루엔자 사백신은 완벽하고 비가역적인 불활화를 통해 안정성을 보장할 뿐만 아니라, 높은 면역원성을 통해 침입하는 야생형 바이러스에 대해 효과적인 방어를 제공할 수 있는 가능성을 보였다. 그러므로, 현재 사백신 제조시 사용하는 독성화학물질을 대체하는 천연물질인 녹차카테킨을 이용한 사백신 제조 기술을 본 연구를 통해 확보하였고, 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 다른 바이러스 백신에 적용할 수 있는 플랫폼을 개발하였다.
전염성 바이러스의 감염으로부터 방어하기 위한 가장 효과적인 방법은 백신접종을 통한 예방이다． 현재까지 개발되고 있는 바이러스 사백신은 화학물질 기반으로， 포르말린 혹은 베타－프로피오락톤을 처리하여 생산한다． 최근까지 포르말린－사백신은 성공적으로 개발되고 있고 산업적으로 대량 생산의 효율이 좋기 때문에 매우 경제적으로 사용되고 있다． 그러나，이러한 화학물질 기반 백신은 우리 몸에 남을 잔류량에 의한 잠재하는 부작용을 최소한으로 하는 정제단계가 필요하다. 또한 이전에 발표되었던 논문에서, 포르말린 기반 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV: respiratory syncytial virus）혹은 홍역 백신을 접종 받은 후에 바이러스에 감염될 경우 질병이 더욱 악화되는 사례가 보고되고 있다. 이러한 이유로， 백신을 제조 시 바이러스 불활화를 위해 사용하던 포르말린을 대체하는 안전성이 보장되는 새로운 방법이 필요하다. 이에 본 연구는 이러한 목적의 일환으로 새로운 형태의 바이러스 불활성화 방법을 고안하고 이를 사백신 제작에 응용함으로써, 사백신 제작 기술의 확장을 목표로 삼았다. 녹차는 Camellia sinensis 식물에서 생산되며, 주요 카테킨은 에피갈로카테킨 (EGC: epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트 (ECG: epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG: epigallocatechin gallate) 및 에피키테킨 (EC: epicatechin)으로 이루어져있다． 녹차추출물의 가장 주요 카테킨인 EGCG는 우리 몸에 안전하고, 내성을 가지고 있으며, 항바이러스, 항산화, 항박테리아, 항암 등의 다양한 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 녹차 추출물을 인플루엔자 바이러스에 농도별로 처리하여 시간이 지남에 따라 바이러스의 감염성이 저해되는 것을 확인하였다． 또한, 인플루엔자 바이러스 단백질과 녹차 추출물을 반응시킨 후, 전기영동법을 통해 녹차 추출물이 결합되어 단백질의 분자량이 증가된 것을 확인하였다． EGCG를 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질에 처리하여 LCMS/MS를 분석한 결과, 디하이드로에피갈로카테킨 (Dygydroepigallocatechin) 형태로 변형되어 헤마글루티닌 단백질의 152번째 시스테인에 결합하여 51.9%의 변형을 일으킨 것을 확인할 수 있었고, 아주 적은 확률로 222번째 티로신과 319번째 시스테인에도 결합된 것을 확인하였다. 또한, 인플루엔자의 에피톱 펩타이드에 포름알데하이드와 EGCG를 처리하였을 때, EGCG에 의한 단백질 변형이 포름알데하이드에 비해 현저히 적은 것을 확인할 수 있었다. 그러므로, 녹차 처리에 의해 에피톱의 고정잔기(anchor residue)의 보존성이 다른 백신에도 적용될 수 있는지를 확인하기 위해, 직선의 에피톱의 아미노산 조성을 분석하였고, 인간 MHC molecule에 바인딩하기위한 각 아미노산의 중요성을 분석하였다. 20개의 아미노산 중, 시스테인 잔기는 에피톱에서 가장 드물게 나타났다. 시스테인이 EGCG에 의한 변형의 첫번째 타겟임을 고려하면, 불활화 제제로써 EGCG의 사용은 포르말린 기반 백신보다 더 뛰어난 항체생산을 할 수 있는 능력을 가진 백신을 만들 수 있다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과를 기반으로, 인플루엔자 바이러스 사백신을 제조하였고, 불활화백신으로 사용하기 위해 바이러스 증식을 비가역적으로 불활화하는지를 확인하였다. 유정란에서의 계대배양， 마우스에서의 비강접종， 글루타티온 （glutathione)과 아스코르브산 （ascorbic acid）이 존재하는 환원환경의 동물세포에서, 모두 바이러스의 감염성을 재현하는 것에 실패함으로써 비가역적으로 불화화됨을 확인하였다. 마우스를 이용한 동물모델에서, 녹차 독성 테스트를 통해 녹차기반 백신의 녹차 잔류가 미치는 해로운 영향이 없다는 안전성을 입증하였다. 또한，녹차 추출물을 사용하면， 화학물질기반 백신 생산 시 투석을 통한 잔류 화학물질 제거과정이 불필요 하여 경제적인 이점이 있다는 것을 알 수 있었다. 녹차 기반 사백신을 효능평가 결과， 매우 강한 면역원성을 보여주었으며, 특히 근육주사의 경우 포르말린 기반 사백신 보다 녹차 기반 사백신에서 높은 헤마글루티네이션 억제 항체와 중화항체를 유도한 것을 확인하였다. 이렇게 유도된 항체의 항원에 대한 친화성을 효소면역분석법 (ELISA)을 이용하여 확인한 결과, 항원-항체 결합에 다양한 농도의 요소로 세척해 주었을 때, 녹차 기반 사백신에서 더 강력한 유지능력을 지니는 것을 확인하였다. 또한, 녹차 처리시 발생하는 비공유결합의 연관성에 대해서도, endosome과 같은 환경인 산도 5.2의 버퍼로 항원-항체 결합을 세척해주었을 때, 녹차 처리 바이러스와 포르말린 처리 바이러스에 대한 항체값이 거의 동일하게 나타난 것을 확인하였다. 특히, 독성을 가진 야생형 바이러스의 대한 방어능력도 우수하여 치사율 이상의 공격접종에서도 완벽한 생존률을 나타내었고, 폐에서의 바이러스 증식도 효과적으로 저해하였음을 보여주었다. 결론적으로 본 연구를 통해 개발한 녹차 기반 인플루엔자 사백신은 완벽하고 비가역적인 불활화를 통해 안정성을 보장할 뿐만 아니라, 높은 면역원성을 통해 침입하는 야생형 바이러스에 대해 효과적인 방어를 제공할 수 있는 가능성을 보였다. 그러므로, 현재 사백신 제조시 사용하는 독성화학물질을 대체하는 천연물질인 녹차카테킨을 이용한 사백신 제조 기술을 본 연구를 통해 확보하였고, 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 다른 바이러스 백신에 적용할 수 있는 플랫폼을 개발하였다.
Traditionally, toxic chemicals, formalin or β-propiolactone, have been widely used as inactivating agents for preparing inactivated viral vaccines. Here I introduce a new vaccine platform used green tea (GT) catechins. GT (Camellia sinensis) is one of the most popular beverages worldwide and has bee...
Traditionally, toxic chemicals, formalin or β-propiolactone, have been widely used as inactivating agents for preparing inactivated viral vaccines. Here I introduce a new vaccine platform used green tea (GT) catechins. GT (Camellia sinensis) is one of the most popular beverages worldwide and has been considered to have many benefits to human health. Here, I show that natural catechins from GT could be used as effective inactivating agents for preparing inactivated influenza vaccines with desired level of immunogenicity and protective efficacy. The treatment with GT extracts result in a complete and irreversible inactivation of influenza viruses in a dose-dependent manner. When the GT-inactivated (GTi) influenza vaccine are inoculated in naïve mice, robust systemic anti-influenza antibody responses were elicited, providing the mice with complete protection from lethal infection with wild type viruses. Mass analyses confirmed that EGCG, the major catechin compound in GT, was shown to crosslink with cysteine residue in influenza hemagglutinin (HA). In contrasts to formalin, that cross-reacts with ε-amino group of lysine, a distinctive mechanism of catechin-mediated inactivation is expected to better preserve major epitopes contributing to vaccine efficacy and safety. The results underscore the need for further studies on the catechin-mediated inactivation for translating it into clinically relevant viral vaccine strategy. With proven health benefits, safety, and tolerability, GT catechins have a great potential for improving traditional vaccines and developing unmet-need vaccines for emerging viral disease.
Traditionally, toxic chemicals, formalin or β-propiolactone, have been widely used as inactivating agents for preparing inactivated viral vaccines. Here I introduce a new vaccine platform used green tea (GT) catechins. GT (Camellia sinensis) is one of the most popular beverages worldwide and has been considered to have many benefits to human health. Here, I show that natural catechins from GT could be used as effective inactivating agents for preparing inactivated influenza vaccines with desired level of immunogenicity and protective efficacy. The treatment with GT extracts result in a complete and irreversible inactivation of influenza viruses in a dose-dependent manner. When the GT-inactivated (GTi) influenza vaccine are inoculated in naïve mice, robust systemic anti-influenza antibody responses were elicited, providing the mice with complete protection from lethal infection with wild type viruses. Mass analyses confirmed that EGCG, the major catechin compound in GT, was shown to crosslink with cysteine residue in influenza hemagglutinin (HA). In contrasts to formalin, that cross-reacts with ε-amino group of lysine, a distinctive mechanism of catechin-mediated inactivation is expected to better preserve major epitopes contributing to vaccine efficacy and safety. The results underscore the need for further studies on the catechin-mediated inactivation for translating it into clinically relevant viral vaccine strategy. With proven health benefits, safety, and tolerability, GT catechins have a great potential for improving traditional vaccines and developing unmet-need vaccines for emerging viral disease.
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