심장비대증과 관련하여 히스톤탈아세틸화 효소 2 (Histone deacetylase 2, HDAC2)의 역할은 많이 연구되어 있다. 심장 비대화 자극은 p300/CBP 관련 인자 (p300/CBP-associated factor, pCAF)를 활성화 시키고, pCAF는 HDAC2와 상호작용함으로써 HDAC2를 아세틸화한다. pCAF가 HDAC2의 아세틸화를 일으킨다는 사실은 기존에 밝혀졌던 심장에서의 HDAC2 관련 기전을 다시 한번 증명함으로써 확인되었다. 본 연구진은 심장에서 pCAF의 역할을 보다 더 깊이 연구하기 위해 ...
심장비대증과 관련하여 히스톤탈아세틸화 효소 2 (Histone deacetylase 2, HDAC2)의 역할은 많이 연구되어 있다. 심장 비대화 자극은 p300/CBP 관련 인자 (p300/CBP-associated factor, pCAF)를 활성화 시키고, pCAF는 HDAC2와 상호작용함으로써 HDAC2를 아세틸화한다. pCAF가 HDAC2의 아세틸화를 일으킨다는 사실은 기존에 밝혀졌던 심장에서의 HDAC2 관련 기전을 다시 한번 증명함으로써 확인되었다. 본 연구진은 심장에서 pCAF의 역할을 보다 더 깊이 연구하기 위해 유전체 교정을 위한 유전자가위의 종류 중 하나인 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9)을 이용하여 pCAF 유전자를 녹아웃 시킨 세포와 쥐를 제작하였다. CRISPR/Cas9 시스템은 유전체 편집기술로서 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 발현시켜 녹아웃 세포 또는 동물을 제작하는 데 사용되어진다. Cas9 효소는 genomic DNA에 이중나선손상을 만들고, 가이드 RNA는 특정 유전체 부위에 Cas9을 표적으로 한다. pCAF 녹아웃 세포를 제작하기 위해 pCAF 유전자의 첫 번째 엑손을 표적하는 가이드 RNA를 융합 복제 기술을 통해 pSpCas9 벡터로 집어넣었다. 올바른 서열을 가진 가이드 RNA가 삽입된 클로닝 벡터의 서열은 생거 시퀀싱으로 확인되었다. 그 플라스미드를 세포에 형질주입 한 후, genomic DNA와 단백질을 추출해 각각 T7E1과 웨스턴 블롯 분석을 통해 pCAF 유전자 돌연변이 여부와 pCAF 단백질 발현 정도를 확인하였다. 동일한 기술을 이용하여 pCAF 유전자 녹아웃 쥐를 제작하였다. pCAF 유전자의 두 번째 엑손을 표적으로 하는 Cas9 전령 RNA 및 가이드 RNA를 쥐의 배아에 미세 주입법으로 동시에 넣음으로써 pCAF 유전자 돌연변이가 발생한 쥐가 탄생하였다. pCAF 돌연변이는 다음 세대의 쥐에서도 안정적으로 일어났다. 동형접합인 쥐의 근육, 심장, 혈관 조직으로부터 단백질을 추출하여 pCAF 발현 수준을 확인한 결과, 모든 조직에서 pCAF 단백질 발현이 감소한 것을 확인하였다. 결과적으로 우리는 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 특정 부위에 pCAF 유전자 돌연변이가 발생한 녹아웃 쥐를 얻을 수 있었다. 그리고 이 쥐를 사용하여 pCAF 유전자가 심장 질환, 특히 심장 비대에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구를 진행하고 있다.
심장비대증과 관련하여 히스톤 탈아세틸화 효소 2 (Histone deacetylase 2, HDAC2)의 역할은 많이 연구되어 있다. 심장 비대화 자극은 p300/CBP 관련 인자 (p300/CBP-associated factor, pCAF)를 활성화 시키고, pCAF는 HDAC2와 상호작용함으로써 HDAC2를 아세틸화한다. pCAF가 HDAC2의 아세틸화를 일으킨다는 사실은 기존에 밝혀졌던 심장에서의 HDAC2 관련 기전을 다시 한번 증명함으로써 확인되었다. 본 연구진은 심장에서 pCAF의 역할을 보다 더 깊이 연구하기 위해 유전체 교정을 위한 유전자가위의 종류 중 하나인 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9)을 이용하여 pCAF 유전자를 녹아웃 시킨 세포와 쥐를 제작하였다. CRISPR/Cas9 시스템은 유전체 편집기술로서 가이드 RNA와 Cas9 단백질을 발현시켜 녹아웃 세포 또는 동물을 제작하는 데 사용되어진다. Cas9 효소는 genomic DNA에 이중나선손상을 만들고, 가이드 RNA는 특정 유전체 부위에 Cas9을 표적으로 한다. pCAF 녹아웃 세포를 제작하기 위해 pCAF 유전자의 첫 번째 엑손을 표적하는 가이드 RNA를 융합 복제 기술을 통해 pSpCas9 벡터로 집어넣었다. 올바른 서열을 가진 가이드 RNA가 삽입된 클로닝 벡터의 서열은 생거 시퀀싱으로 확인되었다. 그 플라스미드를 세포에 형질주입 한 후, genomic DNA와 단백질을 추출해 각각 T7E1과 웨스턴 블롯 분석을 통해 pCAF 유전자 돌연변이 여부와 pCAF 단백질 발현 정도를 확인하였다. 동일한 기술을 이용하여 pCAF 유전자 녹아웃 쥐를 제작하였다. pCAF 유전자의 두 번째 엑손을 표적으로 하는 Cas9 전령 RNA 및 가이드 RNA를 쥐의 배아에 미세 주입법으로 동시에 넣음으로써 pCAF 유전자 돌연변이가 발생한 쥐가 탄생하였다. pCAF 돌연변이는 다음 세대의 쥐에서도 안정적으로 일어났다. 동형접합인 쥐의 근육, 심장, 혈관 조직으로부터 단백질을 추출하여 pCAF 발현 수준을 확인한 결과, 모든 조직에서 pCAF 단백질 발현이 감소한 것을 확인하였다. 결과적으로 우리는 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 특정 부위에 pCAF 유전자 돌연변이가 발생한 녹아웃 쥐를 얻을 수 있었다. 그리고 이 쥐를 사용하여 pCAF 유전자가 심장 질환, 특히 심장 비대에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구를 진행하고 있다.
HDAC2 has been reported to play a role in cardiac hypertrophy. Hypertrophic stress activates p300/CBP-associated factor (pCAF), which acetylates HDAC2 by interacting with HDAC2. pCAF-induced acetylation of HDAC2 was confirmed by demonstrating the mechanism of HDAC2 in cardiac hypertrophy, which was ...
HDAC2 has been reported to play a role in cardiac hypertrophy. Hypertrophic stress activates p300/CBP-associated factor (pCAF), which acetylates HDAC2 by interacting with HDAC2. pCAF-induced acetylation of HDAC2 was confirmed by demonstrating the mechanism of HDAC2 in cardiac hypertrophy, which was reported previously. In the present study, to investigate the role of pCAF in the heart, I used clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 endonucleases (CRISPR/Cas9) to knockout pCAF in cells and mice. The CRISPR/Cas9 system is an important genome editing technology that can be used to generate knockout cells or animals by expressing a single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease. The Cas9 enzyme creates a double-strand break in genomic DNA and a guide RNA targets Cas9 to a specific genomic site. To knockout pCAF in cells, I inserted a sgRNA targeting the first exon of the pCAF gene into a BbsI-digested pSpCas9 vector by fusion cloning methods. Cloned pSpCas9-pCAF sgRNA constructs were confirmed by Sanger sequencing. Next, the pCAF sgRNA plasmid was transfected into cells, genomic DNA was isolated for the T7 Endonuclease I assay, and protein levels of pCAF were evaluated by western blot analysis. Through co-microinjection of Cas9 mRNA and guide RNA targeting the second exon of the pCAF gene into mouse embryos, pCAF frameshift mutant mice strains were obtained. Sequencing analysis of F0 mice was performed to confirm that the frameshift mutation had occurred. These mutants were also observed in the next generation. Homozygous mice were sacrificed to determine pCAF protein levels. The proteins were extracted from mice tissues such as the skeletal muscle, heart, and aorta. pCAF expression in homozygous mice was reduced. Therefore, mouse strains with abolished pCAF were generated using the CRISPR/Cas9 system. With these mice, I have been studying the role of pCAF in cardiac disease, especially cardiac hypertrophy.
HDAC2 has been reported to play a role in cardiac hypertrophy. Hypertrophic stress activates p300/CBP-associated factor (pCAF), which acetylates HDAC2 by interacting with HDAC2. pCAF-induced acetylation of HDAC2 was confirmed by demonstrating the mechanism of HDAC2 in cardiac hypertrophy, which was reported previously. In the present study, to investigate the role of pCAF in the heart, I used clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 endonucleases (CRISPR/Cas9) to knockout pCAF in cells and mice. The CRISPR/Cas9 system is an important genome editing technology that can be used to generate knockout cells or animals by expressing a single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease. The Cas9 enzyme creates a double-strand break in genomic DNA and a guide RNA targets Cas9 to a specific genomic site. To knockout pCAF in cells, I inserted a sgRNA targeting the first exon of the pCAF gene into a BbsI-digested pSpCas9 vector by fusion cloning methods. Cloned pSpCas9-pCAF sgRNA constructs were confirmed by Sanger sequencing. Next, the pCAF sgRNA plasmid was transfected into cells, genomic DNA was isolated for the T7 Endonuclease I assay, and protein levels of pCAF were evaluated by western blot analysis. Through co-microinjection of Cas9 mRNA and guide RNA targeting the second exon of the pCAF gene into mouse embryos, pCAF frameshift mutant mice strains were obtained. Sequencing analysis of F0 mice was performed to confirm that the frameshift mutation had occurred. These mutants were also observed in the next generation. Homozygous mice were sacrificed to determine pCAF protein levels. The proteins were extracted from mice tissues such as the skeletal muscle, heart, and aorta. pCAF expression in homozygous mice was reduced. Therefore, mouse strains with abolished pCAF were generated using the CRISPR/Cas9 system. With these mice, I have been studying the role of pCAF in cardiac disease, especially cardiac hypertrophy.
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