배경과 목적: 구강 건조증은 두경부암의 방사선 치료, 쇼그렌 병, 노화에 의한 타액선의 기능 저하 등에 의해 발생할 수 있다. 구강 건조증을 치료하기 위한 치료제로는 Pilocarpine이 유일하며, 이 또한 타액선 기능이 남아있는 경우에만 유용하다. 현재, 타액선 기능 저하를 극복하기 위한 대안으로, 타액선 성체 줄기세포 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 가장 실현 가능성이 높은 치료방법으로 생각되고 있다. 이에 본 저자는 타액선 기능 저하 질병 ...
배경과 목적: 구강 건조증은 두경부암의 방사선 치료, 쇼그렌 병, 노화에 의한 타액선의 기능 저하 등에 의해 발생할 수 있다. 구강 건조증을 치료하기 위한 치료제로는 Pilocarpine이 유일하며, 이 또한 타액선 기능이 남아있는 경우에만 유용하다. 현재, 타액선 기능 저하를 극복하기 위한 대안으로, 타액선 성체 줄기세포 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 가장 실현 가능성이 높은 치료방법으로 생각되고 있다. 이에 본 저자는 타액선 기능 저하 질병 동물모델을 개발하여, 방사선 조사 후 타액선 조직의 미세 환경을 이해함으로써, 조직재생 연구에 유용한 프로토콜로 활용하고자 하였다. 또한, 환자 유래 타액선 조직 줄기세포 기반 다종 타액선 줄기세포 형성기술의 개발 및 3차원생체재료 기반 오가노이드의 최적화 구조를 만들고자 하였다.
재료 및 방법: 첫 번째로 타액선 기능 저하 동물모델을 개발하기 위하여, 13주 된C57BL/6 마우스의 타액선 부위에 총 15Gy의 방사선을 1.5Gy/min으로 조사한 후, 7일 이후에 마우스의 몸무게, 악하선의 크기와 무게, 필로칼핀 주입 후의 타액의 양을 대조군과 비교하였다. 또한, 마우스의 악하선 조직을 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry, IHC), 면역형광염색법(Immunofluorscence, IF)과 정량 실시간 중합요소 연쇄 반응(Quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 통하여 대조군과 비교 분석하였다. 두 번째로 환자 타액선 조직으로부터 효소를 이용하여 배양 후, 타액선 줄기세포를 분리 및 분화하였다. 타액선 줄기세포의 검증을 위해 유세포 분석(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)을 시행하였다. 또한, 이를 3차원 배양을 통하여, 다분화성 타액선 줄기세포 배양을 시도하였으며, 이를 검증하기 위해 특이 단백질 활성도를 대조군과 비교 분석하였다.
결과: 방사선을 타액선에 조사 한 군과 조사하지 않은 대조군과의 7일 뒤, 마우스의 몸무게, 악하선의 무게와 크기, 타액 분비량을 비교 분석하였으며, 대조군에 비하여, 방사선을 조사한 마우스의 몸무게, 악하선의 무게와 크기 및 타액의 분비량이 감소하는 양상을 관찰하였다. 또한, 방사선 조사 악하선을 분리하여 면역조직화학염색을 시행하였으며, 병리학적으로 세포의 퇴행(Degradation)과 액포화(Vacuolization), 핵농축(Pycnosis)이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 콜라겐 Type I 면역형광염색에서는 콜라겐의 발현이 대조군에 비해 증가함을 알 수 있었다. 중합 효소 연쇄반응에서는 대조군에 비하여, Tumor necrosis factor(TNF)-α, Connective tissue growth factor(CTGF), Cyclin D1(CCND1), P21은 증가 되는 소견을 보이는 반면, Sex determining region Y-Box transcription factor 2(SOX2)와 Amylase 1(Amy 1), Lamin A/C(LMNA)는 감소 되는 것을 확인하였다. 환자 유래 타액선 조직 줄기세포의 분리는 배양 2일 째부터 여러 가지 형태로 자라나면서, 군락을 형성하기 시작하여 6일째에 이르러서는 하나의 큰 군락을 형성하였다. 이후, 3차원 배양을 통하여 타액선 스페로이드(Spheroid)로 분화하는데 성공하였으며, 유세포 분석 분석을 통한 환자 유래 타액선 줄기세포에서 줄기세포 표지자들인 CD44, 73, 166, 105가 약 90% 이상 발현되고 있음을 확인하였으며, CD31, 34, 45 에서는 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, 성장인자를 넣은 배지를 통해, 선방세포(Acinar cell)로의 분화에 성공하였으며, Amylase 1A와 Keratin 5 유전자 발현의 증가를 통해 선방세포의 기능을 확인하였다.
결론: 타액선 기능 저하 동물모델 개발 및 미세 환경의 분석으로 반복적인 방사선 조사는 타액선 조직의 DNA 손상 및 활성화 산소를 발생시켜 국소 염증 반응을 일으키고 이는 결국 섬유화 반응으로 진행된다는 것을 알 수 있었다. 본 연구자들은 3차원 배양법을 이용하여 환자 유래 타액선에서 스페로이드(Spheroid) 분리 배양에 성공하였으며, 이는 기존의 골수나 지방 등에서 유래한 줄기세포와 다르게 상피세포 표현형도 발현함을 확인하였으며, 이번 연구를 통해 고기능성 타액선 오가노이드 형성기술에 한발 다가서게 되었다.
배경과 목적: 구강 건조증은 두경부암의 방사선 치료, 쇼그렌 병, 노화에 의한 타액선의 기능 저하 등에 의해 발생할 수 있다. 구강 건조증을 치료하기 위한 치료제로는 Pilocarpine이 유일하며, 이 또한 타액선 기능이 남아있는 경우에만 유용하다. 현재, 타액선 기능 저하를 극복하기 위한 대안으로, 타액선 성체 줄기세포 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 가장 실현 가능성이 높은 치료방법으로 생각되고 있다. 이에 본 저자는 타액선 기능 저하 질병 동물모델을 개발하여, 방사선 조사 후 타액선 조직의 미세 환경을 이해함으로써, 조직재생 연구에 유용한 프로토콜로 활용하고자 하였다. 또한, 환자 유래 타액선 조직 줄기세포 기반 다종 타액선 줄기세포 형성기술의 개발 및 3차원 생체재료 기반 오가노이드의 최적화 구조를 만들고자 하였다.
재료 및 방법: 첫 번째로 타액선 기능 저하 동물모델을 개발하기 위하여, 13주 된C57BL/6 마우스의 타액선 부위에 총 15Gy의 방사선을 1.5Gy/min으로 조사한 후, 7일 이후에 마우스의 몸무게, 악하선의 크기와 무게, 필로칼핀 주입 후의 타액의 양을 대조군과 비교하였다. 또한, 마우스의 악하선 조직을 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry, IHC), 면역형광염색법(Immunofluorscence, IF)과 정량 실시간 중합요소 연쇄 반응(Quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 통하여 대조군과 비교 분석하였다. 두 번째로 환자 타액선 조직으로부터 효소를 이용하여 배양 후, 타액선 줄기세포를 분리 및 분화하였다. 타액선 줄기세포의 검증을 위해 유세포 분석(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)을 시행하였다. 또한, 이를 3차원 배양을 통하여, 다분화성 타액선 줄기세포 배양을 시도하였으며, 이를 검증하기 위해 특이 단백질 활성도를 대조군과 비교 분석하였다.
결과: 방사선을 타액선에 조사 한 군과 조사하지 않은 대조군과의 7일 뒤, 마우스의 몸무게, 악하선의 무게와 크기, 타액 분비량을 비교 분석하였으며, 대조군에 비하여, 방사선을 조사한 마우스의 몸무게, 악하선의 무게와 크기 및 타액의 분비량이 감소하는 양상을 관찰하였다. 또한, 방사선 조사 악하선을 분리하여 면역조직화학염색을 시행하였으며, 병리학적으로 세포의 퇴행(Degradation)과 액포화(Vacuolization), 핵농축(Pycnosis)이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 콜라겐 Type I 면역형광염색에서는 콜라겐의 발현이 대조군에 비해 증가함을 알 수 있었다. 중합 효소 연쇄반응에서는 대조군에 비하여, Tumor necrosis factor(TNF)-α, Connective tissue growth factor(CTGF), Cyclin D1(CCND1), P21은 증가 되는 소견을 보이는 반면, Sex determining region Y-Box transcription factor 2(SOX2)와 Amylase 1(Amy 1), Lamin A/C(LMNA)는 감소 되는 것을 확인하였다. 환자 유래 타액선 조직 줄기세포의 분리는 배양 2일 째부터 여러 가지 형태로 자라나면서, 군락을 형성하기 시작하여 6일째에 이르러서는 하나의 큰 군락을 형성하였다. 이후, 3차원 배양을 통하여 타액선 스페로이드(Spheroid)로 분화하는데 성공하였으며, 유세포 분석 분석을 통한 환자 유래 타액선 줄기세포에서 줄기세포 표지자들인 CD44, 73, 166, 105가 약 90% 이상 발현되고 있음을 확인하였으며, CD31, 34, 45 에서는 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, 성장인자를 넣은 배지를 통해, 선방세포(Acinar cell)로의 분화에 성공하였으며, Amylase 1A와 Keratin 5 유전자 발현의 증가를 통해 선방세포의 기능을 확인하였다.
결론: 타액선 기능 저하 동물모델 개발 및 미세 환경의 분석으로 반복적인 방사선 조사는 타액선 조직의 DNA 손상 및 활성화 산소를 발생시켜 국소 염증 반응을 일으키고 이는 결국 섬유화 반응으로 진행된다는 것을 알 수 있었다. 본 연구자들은 3차원 배양법을 이용하여 환자 유래 타액선에서 스페로이드(Spheroid) 분리 배양에 성공하였으며, 이는 기존의 골수나 지방 등에서 유래한 줄기세포와 다르게 상피세포 표현형도 발현함을 확인하였으며, 이번 연구를 통해 고기능성 타액선 오가노이드 형성기술에 한발 다가서게 되었다.
Current therapies, such as artificial saliva substitutes or systemic sialogogues(Pilocarpine) provide temporary relief of xerostomia(induced by radiation or Sjogren's syndrome). All treatment options are temporary and no effect. Human salivary gland-derived stem cells possess a great potential to di...
Current therapies, such as artificial saliva substitutes or systemic sialogogues(Pilocarpine) provide temporary relief of xerostomia(induced by radiation or Sjogren's syndrome). All treatment options are temporary and no effect. Human salivary gland-derived stem cells possess a great potential to differentiate into multiple lineages and self-renewal capacity, allowing them to be utilized as patient-specific cell-based therapeutics. Although various stem cells-derived acinar cells or saliva-producing progenitor cells has been proposed as a novel approach for treating radiation-induced xerostomia and Sjogren's syndrome. Therefore, we propose the alternative patient-derived stem cell therapy to repair damaged salivary glands and generate new salivary gland tissues. First, we focus on development of radiation induced dry mouth animal model. After receiving X-ray irradiation(15Gy) on C57BL/6 mice, histological evaluation and qPCR analysis of cells within submandibular gland tissue were performed. ECM(Extra cellulcar matrix) remodeling and dysfunctions of salivary gland were observed on various histological evaluation. And qPCR results demonstrated that inflammation, fibrosis, apoptosis and dysfunctions of salivary gland were observed. Second, we performed the isolation of patient's salivary gland tissue-derived mesenchymal stem cell successfully. And we observed mesenchymal stem cell phenotypes from patient's salivary gland tissue-derived cells on Flow cytometry. Also, our initial findings demonstrated that cells cultured on 3D bioprintable matrix were able to survive, proliferate, and form acinar cell-like 3D organoids. In summary, we successfully created a radiation-induced dry mouth animal model and evaluated dysfunctions of salivary gland tissue and its residing cells by histological and gene expression analyses. In addition, we also demonstarated that patient specific stem cells could be isolated from salivary gland with mesenchymal stem cell potintial and these cells could undergo self-assembled organoid formation. Finally, these cells could be highly viable upon photoencapsulation.
Current therapies, such as artificial saliva substitutes or systemic sialogogues(Pilocarpine) provide temporary relief of xerostomia(induced by radiation or Sjogren's syndrome). All treatment options are temporary and no effect. Human salivary gland-derived stem cells possess a great potential to differentiate into multiple lineages and self-renewal capacity, allowing them to be utilized as patient-specific cell-based therapeutics. Although various stem cells-derived acinar cells or saliva-producing progenitor cells has been proposed as a novel approach for treating radiation-induced xerostomia and Sjogren's syndrome. Therefore, we propose the alternative patient-derived stem cell therapy to repair damaged salivary glands and generate new salivary gland tissues. First, we focus on development of radiation induced dry mouth animal model. After receiving X-ray irradiation(15Gy) on C57BL/6 mice, histological evaluation and qPCR analysis of cells within submandibular gland tissue were performed. ECM(Extra cellulcar matrix) remodeling and dysfunctions of salivary gland were observed on various histological evaluation. And qPCR results demonstrated that inflammation, fibrosis, apoptosis and dysfunctions of salivary gland were observed. Second, we performed the isolation of patient's salivary gland tissue-derived mesenchymal stem cell successfully. And we observed mesenchymal stem cell phenotypes from patient's salivary gland tissue-derived cells on Flow cytometry. Also, our initial findings demonstrated that cells cultured on 3D bioprintable matrix were able to survive, proliferate, and form acinar cell-like 3D organoids. In summary, we successfully created a radiation-induced dry mouth animal model and evaluated dysfunctions of salivary gland tissue and its residing cells by histological and gene expression analyses. In addition, we also demonstarated that patient specific stem cells could be isolated from salivary gland with mesenchymal stem cell potintial and these cells could undergo self-assembled organoid formation. Finally, these cells could be highly viable upon photoencapsulation.
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