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문제 정의
- 즉, 근래에 이르러 각종 질환의 병인으로서 활성산소나 free radical이 고려되어지고 있으며 한방약물 중에는 이들 free radical 에 대한 소거작용이나 생성억제작용을 갖고 있다고 하는 연구가 있다.3" 한편 검액 生地黃과 catalpol 함량에 차이가 있는 등 화학적 조성이 다른 두 乾地黃 의 항산화활성을 검토하기 위하여 비교적 안정한 freeradical인 DPPH(l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 소거활성에 대한 영향을 검토하였다. 본 실험에서는 free radical인 DPPH를 사용하여 DPPH에 의하여 발색 되는 자색을 퇴색시키는 정도를 지표로 하여 측정한 바乾地黃 검체 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 공히 검액의 농도의존적으로 강한 라디칼 소거 활성이 인정되었다.
- 1%의 유의한"제효과가 인정되어 초산법에 의한 진통효과가 있음이 I 인정되었으며 각 검체 사이의 효과는 비교적 Sam- plLffl 처치군에서 양호한 결과를 얻었다. 그러나 초삭 writhing syndrome의 억제는 진통작용을 나타내지 I 않는 항히스타민약, 중추흥분약, flavon 등이 있으므로42) 다른 진통작용의 검토법의 도입이 필요하므로 계속하여 추구하고자 한다. 또한 高木 등32)은 barbitu- raje류와 병용투여로 수면시간을 연장시키는 작용을 새는 약물은 진정작용의 중요한 인자라고 밝힌 바 있에, 각 검액을 경구투여한 후 pentobarbital-Na을 투여하여 수면시간 연장에 미치는 영향을 검토한 바 검액 I Sample-II 및 Sample-III 1,000 mg/kg 경구투여군에서 각각 대조군에 비하여 58.
- 특히, 시중에서 유통되고 있는 乾地黃 중의 catalpol 함량세 커다란 편차가 있는 것으로 미루어 보아 地黃을 수치 및 건조하는 과정에서 catalpol의 안정성을 확보하고, 乾地 黃의 생물활성 등 유효성을 보증할 수 있는 품질 표준화가 요망된다. 따라서 , 앞으로 地黃으로부터 乾地黃의 수치공정의 규격화에 관한 연구를 계속하고자 한다.
- 따라서, 乾地黃의 품질평가를 위한 기초적 연구를 위하여 우리 나라에서 유통되고 있는 10종의 乾地黃 을 수집하여 대한약전 일반시험법 중 생약 시험법에 따라 건조감량, 회분 및 산불용성 회분, catalpol 함량을 평가하여 품질평가기준을 설정하고자 하였다.
- 또한, 시중 乾地黃 중에서 catalpol 함량을 기준으로 하여 조사하여 보면 catalpol 함량이 높은 군과 catalpol 함량이 거의 검출되지 않는 군의 두 군으로 나누어짐을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 이화학적인 차이를 생물학적 평가법을 이용하여 품질표준화를 시도하고자 生地黃 및 각각 乾地黃의 물추출물을 검체로 하여 기초약물학적 측면에서 생리활성을 검토하여 약간의 지견을 얻어 그 결과를 보고하고자 한다.
- 지표성분 catalpol 함량 - 地黃의 지표물질인 cat- alpol의 함량 측정은 HPLC를 이용한 정량법에 따라 정량하여 시중에 유통되는 乾地黃의 품질평가의 지표로 하고자 하였다. 乾地黃 중의 catalpol을 정량하고자 90% MeOH로 초음파 추출하여 HPLC를 행한 바 Rt 5.
- 이상의 두 실험 결과에서 DPPH free radical 소거활성과 과산화수소로 유발된 지질과산화에 대한 항산화활성은 乾地 黃의 종류에 따라 많은 편차를 보임이 인정되었다. 특히 catalpol의 함량을 지표로 하였을 때 catalpol 함량이 높은 두 검체는 유사한 효과를 나타내나 catalpol을 거의 함유하지 않은 검체와는 상당한 차이를 나타냄이 인정되고, 이러한 효과는 catalpol 함량과 밀접한 상관관계가 있는 것으로 사료되며 앞으로 계속 추구하고자 한다.
제안 방법
- 31) 즉 생쥐 1군을 5마리로 하여 검액 乾地黃 물추출물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-UI 각각 500 mg/kg 및 1000 mg/kg을 각각 경구 투여한 다음 30 분 후에 0.7% 초산생리식염수액 양을 복강내투여핸 다음 10분 후 10분간의 생쥐가 나타내는 wri thing syndrome의 빈도를 측정하였다.
- 35) 즉, 24 시간 절식시킨 생쥐 1군을 6마리로하여 검액 乾地黃물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-HI 각각 믈추출 500 mg/kg 및 1000 mg/kg을 각각 경구투여하고 30 븐 후에 37°C로 가온된 생리식염수 2.0 ml/mouse씩븍강내에 주사하여 부하시켰다. 즉시 체중을 측정하고 5시간 후에 체중을 측정하여 체중의 차를 이뇨량으로 해였다.
- Catalpol의 함량 -전항에서 조제한 각 검액으로 HPLO 3회 실시하여 얻은 chromatogram의 면적 평균값을 구하여 회귀직선 방정식으로부터 각각 catal pol 함량을 구하였다.
- In vitro에서 세 검체 사이의 생리활성을 비교 검토하고자 항산화활성을 평가하였다. 즉, 근래에 이르러 각종 질환의 병인으로서 활성산소나 free radical이 고려되어지고 있으며 한방약물 중에는 이들 free radical 에 대한 소거작용이나 생성억제작용을 갖고 있다고 하는 연구가 있다.
- Pentobarbital-Na수면시간에 미치는 영향 - 高木 등32 의 방법에 준하여 생쥐 1군을 6마리로 하여 검액 乾地黃 물추출물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 500 mg/kg 및 1000 mg/kg을 각각 경구투여하고 60 분 후에 pentobarbital-Na〔엔토발, 한림제약(주)〕30 mg/kg을 복강내 주사한 후 수면시간을 측정하였다. 수면시 간은 정향반사의 소실로부터 정향반사의 재출현까지 의 시간으로 하여 비교관찰하였다.
- t也黃類는 주로 淸熱作用을 주요한 효능으로 하고있 있어1~5) 각각 건지황의 물추출물이 소화기계의 장관송능에 대한 효과를 검토하기 위하여 생쥐의 소장송능에 대한 효과와 대장수송능을 검토하였다. 소장 수소수송능 생쥐에 BaSQ4현탁액을 경구투여한 후 상법에 따라 개복하여 BaSQ4현탁액의 이동거리로 부터 소장수송능을 산출하였다.
- 乾地黃류의 물추출물이 중추신경계에 대한 영향을 검토하고자 초산법에 의한 진통효과 및 pentobarbital- Na 수면시간 연장작용을 지표로 하였다. Koster 등은 초산을 생쥐나 흰쥐에 투여하면 나타내는 squirming syndrome을 지표로 한 진통작용의 검색법을 보고하였고, 40) Collier 등은 초산을 생쥐의 복강내에 주사하면 생쥐가 나타내는 특유의 writhing syndrome반응을 abdominal contraction response라 하여 이를 억제하는 약물은 진통작용이 있음을 밝힌 바 있다.
- 건조 감량의 측정은 乾地黃이 다량의 당을 함유하고 있고 점조성이 있어 될 수 있는 한 잘게 썰어 사용하였으며, 또한 흡습성이 강하여 건조감량을 구하는 데 어려움이 있어 105°C에서 8시간 건조하였다. 그 결과 건조 감량은 8.
- 인 DPPH(l, l-diphenyl-2-picrylhydra絃yl)을 이용한 Blois의 방법海)에 준하였다. 검액 乾地黃 물추출물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-IH을 MeOH로 실험에 필요로 하는 농도로 희석하여 각 농도당 4 ml 씩 시험관에 옮기고, 여기에 1×l04M DPPH의 메탄올 용액 1 ml을 가한 다음 잘 혼합한 후 실온에서 30분간 방치하고 520nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH를 환원시키는 정도로부터 항산화활성을 산출하였다 .
- 33扁 즉 검액 투여 1시간 전부터 여지 위에 방치하여 해리를 일으키지 않는 생쥐만을 선별하여 1군을 6마리로 하였다. 검액 乾地黃 물추출물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 각각 500 mg/kg 및 1000 mg/kg£ 각각 경구투여하고 30분 후에 25% BaSO4 현탁액 0.1ml/10g을 경구투여하여 BaSQ4가 분변으로 나韋 때 까지의 시간을 측정하여 검액의 효과를 관찰하였다.
- 5 g을 정확히 취하고 90% MeOH 용액 50 ml을 넣고 초음파 추출을 15분 동안 실시한 후 흡인여과하고 다시 90% MeOH 용액으로 세척여과하여 정확히 100 ml가 되게 하여 TLC 및 HPLC용 검액으로 하였다. 검액 및 표준액으로 catalpol과 glucose를 사용하여 각각 50씩을 pre-coated TLC plate(Kiesel gel 60GF254)에 점적한 후 BuOHiEtOH^OrCHCL (2:10:3:6.5)의 전개용매로 TLC를 실시하여 20% 으로 발색시켜 chromatogram을 비교관찰한 결과를 Fig. 2에 나타내었고, 지표물질 catalpol 함량의 측정은 상기의 HPLC법에 따라 각각 측정하였다. TLC chro- matogram에서 지표물질 catalpol이 Rf 0.
- 그리고, 각 검체의 표준화를 위하여 각 물추추물 0.5 g을 정확히 취하고 90% MeOH 용액 50 ml을 넣고 초음파 추출을 15분 동안 실시한 후 흡인여과하고 다시 90% MeOH 용액으로 세척여과하여 정확히 100 ml가 되게 하여 TLC 및 HPLC용 검액으로 하였다. 검액 및 표준액으로 catalpol과 glucose를 사용하여 각각 50씩을 pre-coated TLC plate(Kiesel gel 60GF254)에 점적한 후 BuOHiEtOH^OrCHCL (2:10:3:6.
- 51 mg/ml이었고, 生地黃보다 乾地黃이 낮은 활성을 보인 반면에 乾地黃 중에서도 catalpol 함량과 상관성이 인정되었다. 그리고, 항산화활성을 검토하고자 흰쥐 간 homogenate에서 과산화수소로 유발된 superoxidation activity에 대한검액의 항산화활성을 측정하였다. 그 결과 乾地黃 검체 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 처치로 검액공히 농도의존적인 항산화활성을 보여 주었으며, 각 검체의 IC50은 각각 3.
- 반면에 地黃 중 catalpol 함량만을 지표로 하여 수치 표준화나 품질규격화를 하는 것은 다소 문제가 있을 수 있으므로 생물학적 평가를 병행하여 품질 규격화를 실시하는 것이 필요하다고 생각된다. 따라서, 본 연구자들은 生地黃을 그대로 물로 추출하여 동결건조한 것(Sample-I)을 기준으로 하여 비교 검토하였다. 또한, catalpol의 열에 의한 분해 등을 고려하여 저온에서 건조한 乾地黃(Sample-H), catalpol이 거의 함유되어 있지 않은 乾地黃 (Sample-UI)을 사용하여 각각 물로 추출하여 동결건조한 것을 시료로 하여 생물학적 동등성을 평가흐}고자 in vitro 및 in vitro에서 기초약물학적 측면에서 실험한 결과를 비교 고찰하였다.
- 따라서, 본 연구자들은 生地黃을 그대로 물로 추출하여 동결건조한 것(Sample-I)을 기준으로 하여 비교 검토하였다. 또한, catalpol의 열에 의한 분해 등을 고려하여 저온에서 건조한 乾地黃(Sample-H), catalpol이 거의 함유되어 있지 않은 乾地黃 (Sample-UI)을 사용하여 각각 물로 추출하여 동결건조한 것을 시료로 하여 생물학적 동등성을 평가흐}고자 in vitro 및 in vitro에서 기초약물학적 측면에서 실험한 결과를 비교 고찰하였다.
- 3" 한편 검액 生地黃과 catalpol 함량에 차이가 있는 등 화학적 조성이 다른 두 乾地黃 의 항산화활성을 검토하기 위하여 비교적 안정한 freeradical인 DPPH(l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 소거활성에 대한 영향을 검토하였다. 본 실험에서는 free radical인 DPPH를 사용하여 DPPH에 의하여 발색 되는 자색을 퇴색시키는 정도를 지표로 하여 측정한 바乾地黃 검체 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 공히 검액의 농도의존적으로 강한 라디칼 소거 활성이 인정되었다. 각 농도에서의 라디칼 소거활성으로부터IC50S 산출한 바 Sample-I 0.
- 생리활성시험용 검액의 조제 -지황 중 catalpol 함량에 따라 세 종류로 하여 검체로 하였다. 즉, 生地黃 (이하 Sample-D과 이 生地黃을 저온에서 건조하여 얻은 자가 乾地黃(이흐卜 Sample-II) 및 catalpol 이 거의 검출되지 않는 乾地黃(이하 Sample-UI)을 각 1kg을 세절하여 증류수를 가하여 2시간 2회 환류 추출하여 흡인여과하고 약 30%의 농도가 되도록 감압 농축하였다.
- 대한 효과와 대장수송능을 검토하였다. 소장 수소수송능 생쥐에 BaSQ4현탁액을 경구투여한 후 상법에 따라 개복하여 BaSQ4현탁액의 이동거리로 부터 소장수송능을 산출하였다. 검액 Sample-I 및 Sample-II ! 1,000 mg/kg 각각 경구투여군에서 대조군에 비하여 18.
- 소장수송능에 대한 작용 - 16시간 절식시킨 생쥐 1 군을 6마리로 하여 검액 乾地黃 물추출물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 각각 500 mg/kg 및 1000 mg/kg을 경구투여하고 30분 후에 25% BaSQ4현탁액 0.2 ml/mouse씩 경구투여 하였다. BaSQ4현탁액 투여 20분 흐에 생쥐를 박살시키고 상법에 따라 개복하여 소장을 적출하고 아래 식에 따라 BaSQ4현탁액의 이동률을 산출하였다.
- 소장수송능에 대한 효과 - 생쥐의 BaSQ4현탁액을경구투여한 후 상법에 따라 장관을 적출하여 BaSO4 현탁액의 장관수송거리를 측정하여 장관수송능으로 하였다. 생리식염수만을 투여한 대조군의 BaSO4 이동률은 59.
- 측정하였다. 수면시 간은 정향반사의 소실로부터 정향반사의 재출현까지 의 시간으로 하여 비교관찰하였다.
- 우선 시료의 표준화를 검토하고자 각 시료의 물추출물의 TLC chi旳matogram의 pattern 분석과 HPLC에 의한 catalpol함량을 측정하였다. 우선, TLC를 이용한 한약의 확인시험법은 일반적으로 널리 이용되고 있으며 간편하고 편리한 장점을 가지고 있다.
- 이뇨작용을 검토하기 위하여 생쥐에 생리식염수를 부하시키고 5시간후 체중변화를 이뇨활성의 지표로하였다. 검 액 Sample-I 및 Sample-II 1, 000 mg/kg각각 경구투여 시에 생리식염수만을 처치한 대조군에 비하여 60.
- 이어서 地黃의 지표물질인 catalpol HPLC를 이용하여 각 시료 중에서 함량을 측정하였다. 표준품 catalpol O.
- 따라 세 종류로 하여 검체로 하였다. 즉, 生地黃 (이하 Sample-D과 이 生地黃을 저온에서 건조하여 얻은 자가 乾地黃(이흐卜 Sample-II) 및 catalpol 이 거의 검출되지 않는 乾地黃(이하 Sample-UI)을 각 1kg을 세절하여 증류수를 가하여 2시간 2회 환류 추출하여 흡인여과하고 약 30%의 농도가 되도록 감압 농축하였다. 이 점조성 시료를 동결건조기로 건조하여 각각 물 추출물의 건조분말을 얻어 본 실험에 필요로 하는 농도로 희석하여 사용하였다.
- 시료로 하여 품질평가를 시도하였다. 즉, 이들 각각 시료에 대하여 대한약전 일반시험법의 생약 시험법 항에 준하여 건조감량, 회분시험, 산불용성 회분 시험 및 지표물질인 catalpol함량을 측정하였다. 또한, 시중 乾地黃 중에서 catalpol 함량을 기준으로 하여 조사하여 보면 catalpol 함량이 높은 군과 catalpol 함량이 거의 검출되지 않는 군의 두 군으로 나누어짐을 알 수 있었다.
- 0 ml/mouse씩븍강내에 주사하여 부하시켰다. 즉시 체중을 측정하고 5시간 후에 체중을 측정하여 체중의 차를 이뇨량으로 해였다.
- 표준 검량선의 작성 -정량용 catalpol 표준품을 methanol에 용해하여 농도가 2.0mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 Xml 인 용액을 만들어 표준용액으로 하였고, 상기의 HPLC 조건에 따라 HPLC를 실시하고 각각의 peak area< 산출한 후 peak area의 비와 절대 농도를 plot하여 표준 검량선을 작성한 결과는 Fig. 1에 제시한 바와 같으며 그 회귀직선의 방정식은 Y=6.43719-6(r=0.997)로서 농도와 peak area간의 직선성이 인정되었다.
- 항산화작용 - 흰쥐를 ethei로 마취시키고 복부를 절개하여 간문맥에 polyethylene tube를 삽입하여 4°C 0.9% NaCl 용액으로 간을 세척한 후 간을 적출하여 homogenation하였다. 간 homogenate를 0.
대상 데이터
- 준하였다. 33扁 즉 검액 투여 1시간 전부터 여지 위에 방치하여 해리를 일으키지 않는 생쥐만을 선별하여 1군을 6마리로 하였다. 검액 乾地黃 물추출물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 각각 500 mg/kg 및 1000 mg/kg£ 각각 경구투여하고 30분 후에 25% BaSO4 현탁액 0.
- 따라서, 地黃類의 품질표준화에 관한 연구의 일환으로 시중에서 乾地黃으로 유통되고 있는 地黃을 구입하여 시료로 하여 품질평가를 시도하였다. 즉, 이들 각각 시료에 대하여 대한약전 일반시험법의 생약 시험법 항에 준하여 건조감량, 회분시험, 산불용성 회분 시험 및 지표물질인 catalpol함량을 측정하였다.
- 또한 본 실험에서 사용한 기계로는 Ultrasonics(Heat system, Inc Model XL 2010, England), UV spec- trophotometer(UV-160, Shimadzu Co., Japan), Sha king water bath(Han Back Sci, Co, Model HB- 603C, Korea), Centrifuge(Hanil and sorval, Korea), HPLC system(Water Co.. LTD, Korea), Drying oven(창신과학기계, Korea), 회화로(국제과학, Korea), Water bath(Lab-line Instrument.Inc, USA) 등을 각각 사용하였다.
- 실험동물 -본 실험에 사용한 동물은 중앙동물의 ICR계 체중 18〜 24 g의 웅성생쥐 및 Sprague-Daw- ley계 체중 180〜220 g의 웅성 흰쥐를 사용하였으며 사료는 삼양样지사료(주)의 고형사료로 사육하였고 물은 충분히 공급하면서 2주간 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 실험은 특별히 명시하지 않는 한 24 土 2°C에서 실시하였다.
- 실험재료- 본 실험에서는 1998년 12월에 전국 전지역에서 시판되고 있는 지황 10종과 전주시 소재 대농약초에서 생지황을 각각 구입하여 정확히 감별하고 일정한 크기로 분쇄한 후 사용하였으며 그 표본은 본 연구소에 보관하였다.
이론/모형
- DPPH free radical 소거작용 -안정한 free ra- dical 인 DPPH(l, l-diphenyl-2-picrylhydra絃yl)을 이용한 Blois의 방법海)에 준하였다. 검액 乾地黃 물추출물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-IH을 MeOH로 실험에 필요로 하는 농도로 희석하여 각 농도당 4 ml 씩 시험관에 옮기고, 여기에 1×l04M DPPH의 메탄올 용액 1 ml을 가한 다음 잘 혼합한 후 실온에서 30분간 방치하고 520nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH를 환원시키는 정도로부터 항산화활성을 산출하였다 .
- 건조감량시험, 회분 및 산불용성 회분시험 -상기 10종의 지황 검체를 대한약전 일반시험법 중 생약 시험법의 건조감량, 회분시험 및 산불용성 회분시험법에 각각 준하여 실시하였다.6) 실험결과는 3회 실시하여 그 평균치로 나타내었다.
- 대장수송능에 대한 작용 - Ishii 등의 방법에 준하였다. 33扁 즉 검액 투여 1시간 전부터 여지 위에 방치하여 해리를 일으키지 않는 생쥐만을 선별하여 1군을 6마리로 하였다.
- 이뇨작용 - Tanaka 등의 방법에 준하였다.35) 즉, 24 시간 절식시킨 생쥐 1군을 6마리로하여 검액 乾地黃물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-HI 각각 믈추출 500 mg/kg 및 1000 mg/kg을 각각 경구투여하고 30 븐 후에 37°C로 가온된 생리식염수 2.
- 초산법에 의한 진통작용 -Whittle의 방법에 준하였다.31) 즉 생쥐 1군을 5마리로 하여 검액 乾地黃 물추출물 Sample-I, Sample-II 및 Sample-UI 각각 500 mg/kg 및 1000 mg/kg을 각각 경구 투여한 다음 30 분 후에 0.
- 다시 homogenation하였다. 항산화효과는 T. Yokozawa 등의 방법30)을 이용하여 thiobarbituric acid (TBA)-reactive substance법에 따라 실시하였다. 즉 phosphate 완충액 (50mM, pH 7.
성능/효과
- 41) 그리고, Whittle은 생쥐에 초산을 복강에 투여하면 나타내는 writhing syndrome의 억제는 비마약성 진통제에서 나타나는 특이적으로 반응임을 보고하였다.31) 따라서, 이 반응의 억제를 지표로 하여 진통작용을 시험한 바 검액 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 1,000 mg/kg개각 경구투여군에서는 대조군에 비하여 writhing syn- d§me의 억제율은 13.2%, 23.3% 및 32.1%의 유의한"제효과가 인정되어 초산법에 의한 진통효과가 있음이 I 인정되었으며 각 검체 사이의 효과는 비교적 Sam- plLffl 처치군에서 양호한 결과를 얻었다. 그러나 초삭 writhing syndrome의 억제는 진통작용을 나타내지 I 않는 항히스타민약, 중추흥분약, flavon 등이 있으므로42) 다른 진통작용의 검토법의 도입이 필요하므로 계속하여 추구하고자 한다.
- p data-page="1">乾地黃은 현삼과（Scrophulariaceae）에 속하는 다년생 초본인 地黃 Rehmannia glutinosa Liboschttz var purpurea Making 또는 그 밖의 동속식물의 뿌리를 건조한 것이다.1,2) 地黃은 원주형〜방추형을 이루고 길 이 5~ 15 cm, 지름 6〜 15 mm로 때로는 꺾이었거나 변형되어 있다. 바깥면은 황갈색~흑갈색을 띠고 깊 은 세로주름과 가로로 곁뿌리의 자국과 피목이 있으 며, 횡단면은 흑색이며 광택이 있고 평탄하고, 점성이 있으며, 우리 나라에서는 비교적 온난한 중부이남 지방에서 재배되고 있다.
- 2에 나타내었고, 지표물질 catalpol 함량의 측정은 상기의 HPLC법에 따라 각각 측정하였다. TLC chro- matogram에서 지표물질 catalpol이 Rf 0.68에서 검출되었고 Sample-I 및 Sample』에서는 명확하게 검출되었으나, Sample-UI에서는 검출되지 않았다. 반면에 glucose는 I寸 0.
- 하고자 하였다. 乾地黃 중의 catalpol을 정량하고자 90% MeOH로 초음파 추출하여 HPLC를 행한 바 Rt 5.95분에서 분리능이 양호한 peak가 검출되었으며, 각 시료 중에 함유된 catalp이의 함량은 재현성이 있는 결과를 얻을 수 있었다. 시료 중에는 catalpol 함량은 검출되지 않는 시료로부터 최고 3.
- 본 실험에서는 free radical인 DPPH를 사용하여 DPPH에 의하여 발색 되는 자색을 퇴색시키는 정도를 지표로 하여 측정한 바乾地黃 검체 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 공히 검액의 농도의존적으로 강한 라디칼 소거 활성이 인정되었다. 각 농도에서의 라디칼 소거활성으로부터IC50S 산출한 바 Sample-I 0.19 mg/ml, Sample-H 0.42 mg/ml 및 Sample-UI 0.51 mg/ml이었고, 生地黃보다 乾地黃이 낮은 활성을 보인 반면에 乾地黃 중에서도 catalpol 함량과 상관성이 인정되었다. 그리고, 항산화활성을 검토하고자 흰쥐 간 homogenate에서 과산화수소로 유발된 superoxidation activity에 대한검액의 항산화활성을 측정하였다.
- 5시간후 체중변화를 이뇨활성의 지표로하였다. 검 액 Sample-I 및 Sample-II 1, 000 mg/kg각각 경구투여 시에 생리식염수만을 처치한 대조군에 비하여 60.4% 및 45.8%의 유의한 이뇨활성이 인정되었으나 검액 Sample-IH 경구투여시에는 다소 이뇨작용을 억제시키는 경향을 보여 주었다. 北川 등23)은 地黃 중에 함유된 catalpol이 이뇨작용이 있음을 보고한 바 있으며, 본 실험결과에서도 catalpol이 함유된 生地黃 및 乾地黃 물추출물인 Sample-I과 Sample-II 처치군에서 유의한 이뇨효과가 인정됨으로 catalpol이 이뇨 효과에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
- 그리고, 항산화활성을 검토하고자 흰쥐 간 homogenate에서 과산화수소로 유발된 superoxidation activity에 대한검액의 항산화활성을 측정하였다. 그 결과 乾地黃 검체 Sample-I, Sample-II 및 Sample-III 처치로 검액공히 농도의존적인 항산화활성을 보여 주었으며, 각 검체의 IC50은 각각 3.83 mg/ml, 3.34 mg/ml 및 6.64 mg/ml로 Sample-I과 Sample-II는 유사하나 Sample-III와는 현저한 차이가 있음이 인정되었다. 이상의 두 실험 결과에서 DPPH free radical 소거활성과 과산화수소로 유발된 지질과산화에 대한 항산화활성은 乾地 黃의 종류에 따라 많은 편차를 보임이 인정되었다.
- 건조 감량의 측정은 乾地黃이 다량의 당을 함유하고 있고 점조성이 있어 될 수 있는 한 잘게 썰어 사용하였으며, 또한 흡습성이 강하여 건조감량을 구하는 데 어려움이 있어 105°C에서 8시간 건조하였다. 그 결과 건조 감량은 8.8%〜14.4%로 시료마다 약간의 차이를 나타내었으며 평균값은 11.3土1.7%이었다. 회분 함량은 2.
- 그리고, 각 시료의 물추출률과 catalpol 함량을 측정한 결과 각 시료의 물추출률은 건조감량을 고려하지 않고 산출한 경우 15.4%, 60.5% 및 53.0%이었으며 특히, 生地黃의 경우 수분함량이 약 70% 전후이므로 이를 환산하면 약 50% 정도이므로 각 검체의 물 추출률은 유사한 것으로 생각된다. 그리고, 地黃의 지표물질 catalpol 함량은 Sample-I, Sample-II 및 Sample-m 각각 3.
- 2%의 유의한 소장수송능 촉진효과가 인정되었으나 Sample-ni 처치군에서는 다소 촉진시키는경향만을 보여 주었다. 그리고, 대장수송능은 BaSQ 현탁액을 경구투여한 후 생쥐의 분변疝 BaSO/} 배설되는 시간으로 측정하였으며 검액 Sample-I, Sam-ple-II 및 Sample-III 1,000 mg/kg 각각 투여군에서는 생리식염수만을 투여한 대조군에 비하여 57.8%, 31.5% 및 11.6%의 유의한 대장수송능 촉진효과가 인정되었고 이러한 효과는 검액의 농도의존적임을 알수있다. 한편, 地黃의 지표성분인 catalpoP] 사하작용이 있음이 밝혀져 있어23) 生地黃 및 각 乾地黃의 소장수송능 및 대장수송능 촉진효과는 검체 중에 함유된 catalpol의 함량과 밀접한 관련이 있는 것으로 사료된다.
- 0% 이하로 규정되어 있어 기준이내이었다. 그리고, 모래 등 무기물의 혼입을 지표로 하는 산불용성 회분 함량은 한약의 품질보증상 중요시하고 있으며, 地黃 중의 산불용성 회분함량은 0.02%〜1.9%이고 평균은 1.0土0.6%로 대한약전외 한약규격집의 규정 2.0% 이하의 규정에 적합하였다.
- 우선, TLC를 이용한 한약의 확인시험법은 일반적으로 널리 이용되고 있으며 간편하고 편리한 장점을 가지고 있다. 따라서, 地黃 세 시료의 TLC chromatogram pattern분석을 통하여 비교 평가한 바 지표물질인 catalpol이 母' 0.68 에서 검출되었고 Sample-I 및 Sample-IT게서는 명확하게 검출되었으나, Sample-UI에서는 검출되지 않았다. 반면에 glucose는 W 0.
- 필요가 있을 것으로 생각된다. 따라서, 본 실험에서는 105°C에서 8시간 건조하였을 경우에 건조 감량으로 하였으며 그 결과 최하 8.8%에서 최고 14.4 %이었고 평균은 11.3%이었다. 현재 대한약전외 한약규격집에는 규정되어 있지 않으나 흡습성이 강하고 품질 향상과 유통 중의 변질 등을 고려하여 건조 감량 규정의 신설이 요망된다.
- .따라서, 이 방법에 준하여 乾地黃 시료 중의 catalp이함량을 산출한 바 검출되지 않는 검체에서부터 최고 3.89%가 검출되는 등 편차가 매우 크게 나타남이 인정되었으며, 이러한 결과는 일본에서 유통되는 乾地黃 중의 catalpol함량 조사 연구 결과와도 일치하였다.28) 이는 地黃의 산지나 채취 시기 등에 의한 차이가 있을 수 있고, 한편으로는 수치 하는 공정이나 건조온도 등에 의하여 catalpol이 분해되는 것에 기인하는 것으로 사료되며 乾地黃의 품질평가로 catalp이의 함량을 규정하는 것은 수치공정의 표준화 및 건조조건 등을 충분히 고려하여 설정할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 64 mg/ml이었다. 따라서, 이들 세 검체 사이의 H2O2의 항산화효과는 검액 Sample-I과 Sample-II은 유사한 항산화활성을 보인 반면에 Sam- ple-III이 가장 낮은 활성을 보였고, 그 활성은 검액 Sample-I 또는 Sample-II에 비하여 약 50% 정도로 관찰되었다.
- 51 mg/ml이었다. 따라서, 이들 세 검체 사이의 free radical 소거활성은 검액 Sample-I이 가장 우수하고, Sample-II, Sample-IH 순으로 나타남이 관찰되었다
- 0% 이하로 규정하고 있으며 모두 기준 이내를 나타내어 적합하였다. 또한 산불용성 회분함량도 0.2%〜1.9%이고 그 평균값은 1.0土0.6%으로 대한약전외 한약규격집 乾地 黃 산불용성 회분함량이 2.5%이하로 규정하고 있으며 모든 시료는 기준 이내를 나타내어 적합하였다.
- 52에서 검출되었고, Sam- ple-IH에서는 명확하게 나타나나 Sample-I 및 Sam- ple-n에서는 약간 희미하게 검출됨을 알 수 있어 수치 과정 등의 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 또한, 각 시료의 물추출률은 수분함량을 고려하여 산출한바 50.0%, 60.5% 및 53.0%로 물추출률은 유사하였으나, 地黃의 지표물질 catalpol 함량은 Sample-I, Sample-II 및 Sample-UI 각각 3.4%, 2.8% 및 0.05 %으로 건지황 시료 Sample-II 및 Sample-Hit TLC chromatogram과 catalpol 함량을 고려할 때 확실하게구별되어 생물학적 평가의 시료로 이용할 수 있었다.
- 즉, 이들 각각 시료에 대하여 대한약전 일반시험법의 생약 시험법 항에 준하여 건조감량, 회분시험, 산불용성 회분 시험 및 지표물질인 catalpol함량을 측정하였다. 또한, 시중 乾地黃 중에서 catalpol 함량을 기준으로 하여 조사하여 보면 catalpol 함량이 높은 군과 catalpol 함량이 거의 검출되지 않는 군의 두 군으로 나누어짐을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 이화학적인 차이를 생물학적 평가법을 이용하여 품질표준화를 시도하고자 生地黃 및 각각 乾地黃의 물추출물을 검체로 하여 기초약물학적 측면에서 생리활성을 검토하여 약간의 지견을 얻어 그 결과를 보고하고자 한다.
- 68에서 검출되었고 Sample-I 및 Sample』에서는 명확하게 검출되었으나, Sample-UI에서는 검출되지 않았다. 반면에 glucose는 I寸 0.52에서 검출되었고, Sample-Ill에서는 명확하게 나타나나 Sample-I 및 Sample-II에서는 약간 희미하게 검출됨을 알 수 있었다.
- 68 에서 검출되었고 Sample-I 및 Sample-IT게서는 명확하게 검출되었으나, Sample-UI에서는 검출되지 않았다. 반면에 glucose는 W 0.52에서 검출되었고, Sam- ple-IH에서는 명확하게 나타나나 Sample-I 및 Sam- ple-n에서는 약간 희미하게 검출됨을 알 수 있어 수치 과정 등의 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 또한, 각 시료의 물추출률은 수분함량을 고려하여 산출한바 50.
- 제시하였다. 생리식염수만을 투여한 대조군 의 대장수송시간은 402.2土22.11 분을 나타내었으며 生地黃 물추출물 검액 Sample-I 500 m以kg 및 1,000 mg/kg 투여군에서는 각각 228.3土 65.69분과 169.7土 64.48분으로 대조군에 비하여 pv0.001 의 유의한 대장수송능촉진효과가 인정되었다. 그리고, 검액 Sample-II 및 Sample-in 1,000 mg/kg 각각 경구투여군에서는 275.
- 생리식염수만을 투여한 대조군의 BaSO4 이동률은 59.8土 9.26%이었으며, 검 액 Sample-I 및 Sample- n 1,000 mg/kg 투여군에서는 각각 70.7土5.85%와 74.3土5.89%로 대조군에 비하여 p<0.05와 pvOOL의 유의한 소장수송능 촉진효과를 나타내나 검액 Sam- ple-m 처치군에서는 다소 촉진시키는 경향을 보이나 통계적으로 유의차는 인정되지 않았다. 각 검액 공히 저농도 500 mg/kg 처치군에서는 별다른 영향을 주지 못하였다(Table IV).
- 생쥐에 생리식 염수와 0.7% 초산생리식 염수액을 투여한 대조군의 writhing syndrome의 빈도 31.8± 2.78회/10분이었으며, 검액 生地黃 Sample-I, 乾 地黃 Sample-II 및 Sample-Ill 1, 000 mg^kg 각각 경구 투여군에서는 27.6±2.88회/10분, 24.4土 2.97회/10분 및 21.6土 1.52회/10분으로 대조군에 비하여 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 의 유의한 억제효과를 나타내었다. 그리고, 저농도 500m以kg 투여군에서는 검액Sample-II 및 Sample-IH 처치시에만 유의한 writhing syndrome 억제효과를 관찰할 수 있었고, 검 액 Sam- ple-I 처치군에서는 별다른 영향을 미치지 못하였다.
- 효과를 Table Ⅲ에 나타내었다. 생쥐에 생리식염수와 pentobarbital-Na#- 병용투여한 대조군의 수면시간은 36.3土 6.69분이었으며, 검액 Sample-n 500 mg/kg 및 1,000 mgkg 경구투여군에서는 각각 46.7 土6.66분과 57.5土6.6&분으로 대조군에 비하여 p<0.05와 p<0.0()l의 유의한 수면시간 연장효과를 관찰할 수 있었다. 그리고, Sample-Hi 1,000 mg/kg 경구 투여군에서도 50.
- 95분에서 분리능이 양호한 peak가 검출되었으며, 각 시료 중에 함유된 catalp이의 함량은 재현성이 있는 결과를 얻을 수 있었다. 시료 중에는 catalpol 함량은 검출되지 않는 시료로부터 최고 3.89% 함유된 시료 등 catalpol함량이 다양하게 나타남을 알 수 있었다(Table I).
- 이뇨효과 - 생쥐에 생리식염수를 부하시켜 체중 변화를 지표로 하는 이뇨작용에 대한 각 乾地黃 물 추출물의 이뇨효과를 Table VI에 제시하였다, Table VI에 나타낸 바와 같이 생리식염수만을 투여한 대조군의체중변화 1.60±0.62g에 비하여 검액 Sample-I 및 Sample-II 1,000 mg/kg 경구투여군에서는 각각 2.57 土 0.55 g과 2.33土 0.47 g으로 대조군에 비하여 각각 pv0.05의 유의한 체중변화를 보여 주어 이뇨효과가 있음을 알 수 있었다. 반면에 검액 Sample-ffl 1,000 mgkg 경구투여군에서는 체중변화를 관찰할 수 없었다.
- 64 mg/ml로 Sample-I과 Sample-II는 유사하나 Sample-III와는 현저한 차이가 있음이 인정되었다. 이상의 두 실험 결과에서 DPPH free radical 소거활성과 과산화수소로 유발된 지질과산화에 대한 항산화활성은 乾地 黃의 종류에 따라 많은 편차를 보임이 인정되었다. 특히 catalpol의 함량을 지표로 하였을 때 catalpol 함량이 높은 두 검체는 유사한 효과를 나타내나 catalpol을 거의 함유하지 않은 검체와는 상당한 차이를 나타냄이 인정되고, 이러한 효과는 catalpol 함량과 밀접한 상관관계가 있는 것으로 사료되며 앞으로 계속 추구하고자 한다.
- 3%의 유한 수면시간 연장효과를 나타내었으나 검액 Sam-의pli-I 처치군에서는 별다른 영향을 주지 못함을 알 수 있었다. 이상의 실험결과로 미루어보아 중추신경계에대 한 乾地黃류 검액의 효과는 검액 군사이에 차이가있는 것으로 사료되며, 특히 검액 Sample-IU 처치 시 다른 검액 투여군에 비하여 양호한 실험결과를 얻었다.
- 95에서 catalpol peak를 검출되어 .정량이 가능함을 알 수 있었다..
- 0 mg/ml의 각각 농도에서 각 검액의 농도의존적으로 free radical 소거 활성이 인정되었다. 특히 0.5 mg/ml의 농도에서 각 검액의 DPPH free radical 소거활성은 90.2%, 82.4 % 및 73.3%를 나타내었고, IC50를 산출하여 보면 Sample-I 0.19 mg/ml, Sample-II 0.42 mg/ml, Sample-IH 0.51 mg/ml이었다. 따라서, 이들 세 검체 사이의 free radical 소거활성은 검액 Sample-I이 가장 우수하고, Sample-II, Sample-IH 순으로 나타남이 관찰되었다
- 0mg/ml의 각각 농도에서 각 검액의 농도의존적으로 강력한 항산화활성이 인정되었다. 특히 6.0 mg/ml의 농도에서 각 검액의 H2O2의 산화에 대한 항산화활성은 79.0%, 80.4% 및 57.8%를 나타내었고, IC50를 산출하여 보면 Sample-I 3.83 mg/ml, Sample-II 3.34 n@ml, Sample-m 6.64 mg/ml이었다. 따라서, 이들 세 검체 사이의 H2O2의 항산화효과는 검액 Sample-I과 Sample-II은 유사한 항산화활성을 보인 반면에 Sam- ple-III이 가장 낮은 활성을 보였고, 그 활성은 검액 Sample-I 또는 Sample-II에 비하여 약 50% 정도로 관찰되었다.
- 각 시료 중에서 함량을 측정하였다. 표준품 catalpol O.lmg/ml〜2.0mg/ml의 농도에서 원점을 통과하는 양호한 직선성의 검량선을 얻을 수 있었으며 그 회귀직선의 방정식은 y=6.4372-6×(r=0.996)이었다. 그리고, 시료 乾地黃의 HPLC d&romatogram에서 Rt 5.
- 7%이었다. 회분 함량은 2.4%〜5.2%이고 평균값은 4.0土0.8%으로 대한약전 외 한약규격집 乾地黃 회분함량이 6.0% 이하로 규정하고 있으며 모두 기준 이내를 나타내어 적합하였다. 또한 산불용성 회분함량도 0.
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