[논문]지황(地黃)과 발효(醱酵) 지황(地黃)의 생리활성 비교 연구

김은혜; 김경신; 채순기; 김병수; 강정수

지황(地黃)과 발효(醱酵) 지황(地黃)의 생리활성 비교 연구
Comparison of Biological Activities on Rehmanniae Radix and Fermented Rehmanniae Radix 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.26 no.3, 2012년, pp.306 - 313

김은혜 (대전대학교 한의과대학 생리학교실) , 김경신 (대전대학교 한의과대학 생리학교실) , 채순기 (배재대학교 생명공학과) , 김병수 (대전대학교 한의과대학 생리학교실) , 강정수 (대전대학교 한의과대학 생리학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Herbal medicines are medicinal products containing a single or a mixture of two or more different herbal substances or herbal preparations as active principles. Recently, much attention has been paid to developing various kinds of fermented herbal extracts, a new type of traditional herbal medicine in the field of Korean traditional medicine. The fermentation of medicinal herbs is intended to exert a favorable influence on bioestability, bioavaliablilty and pharmacological activity of herbal extract in the gastrointestinal tract as well as intensifying the nutritional and pharmacological aspects of the medicinal herbs. The purpose of this study was to investigate biological activities of fermented Rehmanniae Radix by lactic acid bacteria at $30^{\circ}C$ for 3 days in comparison with those for Rehmanniae Radix The fermented Rehmanniae Radix exhibited different chemical profile to Rehmanniae Radix generated with HPLC, indicating production of new ingredients during fermentation. Rehmanniae Radix served as good nutritional sources for the growth of lactic acid bacteria showing increased number of bacteria during fermentation. Toxic effect of the fermented Rehmanniae Radix to cells were not seen judged by the MTT assay. The fermented Rehmanniae Radix exhibited better antioxidant effect than non-fermented Rehmanniae Radix analyzed by a SOD-likely assay. Both hypoglycemic and hypotensive effects of the fermented Rehmanniae Radix were also detected and better than those for Rehmanniae Radix in showing dose-dependent inhibitory effects on alpha-glucosidase and ACE, respectively. In conclusion, fermented Rehmanniae Radix appears to have more biological activities than non-feremented Rehmanniae Radix showing not only antioxidant effect but also cardiovascular protection.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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제안 방법

0.1 M Na2CO3 750 μl로 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대응하는 α-glucosidase의 IC50을 계산하였다.
ACE 저해활성 측정은 Cushman과 Cheung의 spectrophotometric assay 방법²⁴⁾을 응용하여 측정하였다. 먼저 효소원을 준비하기 위해서 rabbit lung acetone powder 10 g을 50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.
Huh7 cell을 96-well plate에 각각 1×104 Cells/ml의 농도로 200 ㎕씩 분주 한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24 시간 동안 세포를 적응시키고, 시료의 농도가 각각 0-200 μM / 200 ㎕이 되도록 조정한 후 (6개 농도), 200 ㎕씩 세포에 처리하였다.
건지황과 발효지황의 차이를 측정하기 위해서 C₁₈역상 HPLC를 사용한 결과, 앞부분에서 수용 성분을 확인하였다. 발효지황의 HPLC에서는 건지황에서는 나타나지 않았던 성분 (chemical profile)을 확인할 수 있었다(Fig.
27×10⁸(CFU/ml)로, 초기 대비 100배 이상 증가하였다(Table 1). 건지황을 첨가한 후 유산균의 발효 중 pH 변화를 비교하기 위하여 각 시료에 유산균을 접종하고 37℃에서 배양하여 24 시간 단위로 측정하였다. 건지황의 첨가로 인한 발효액의 pH는 초기에는 4.
발효액을 동결건조한 시료를 1%, 5%, 10%, 25% 그리고 50%의 용액으로 만든 후 각 시료용액 0.2 ml에 Tris-HCl의 완충용액 (50 mM Tris 10 mM EDTA, pH 8.5) 3.0 ml와 7.2 mM pyrogallol 0.2 ml를 가하여 25℃에서 10 분간 반응시킨 후 1 N HCl 0.1 ml를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타냈으며 각각의 활성을 %로 나타내었다.
발효지황과 건지황의 항산화 활성을 평가하고자 SOD 활성과 전자 공여능을 실험하였다. Superoxide dismutase(SOD)는 생체에 매우 유해한 superoxide anion radical과 반응하여 과산화수소를 생성하는 효소로 알려져 있으며, 산소를 소비하는 모든 생물 종에 존재하여 생체 내에서 활성산소 장해에 대한 방어 작용을 하는 대표적인 활성산소 저해제이며, 지황의 SOD activity 가 비교적 높게 나타났다는 보고³⁵⁾가 있다.
25% trypsin-EDTA solution으로 flask 바닥으로부터 세포를 유리시켰다. 배지는 이틀에 한번 새로운 배지로 교환 배양 후, 배지를 제거하고, 10% FBS이 함유된 DMEM으로 교체한 다음, 시료를 같은 배지로 적당히 희석 하여 첨가한 후, 5% CO2, 37℃ 조건하에서 세포가 well의 바닥에약 80%이상 될 때까지 배양하였다.
본 연구에서는 유산균을 이용하여 발효지황을 제조하고, 건지황과 발효지황의 pH 및 적정산도, SOD 활성과 전자공여능을 통하여 항산화능, ACE (angiotensin converting enzyme) 활성 저해를 통해 혈당강하와 α-glucosidase 저해 활성과 같은 생리활성 지표를 비교하여 연구 하였다.
생균수는 시료 1 ml를 멸균 생리식염수 9 ml에 희석하고 단계별로 희석 후 1 ml를 취하여 Lactobacillus 속과 Pediococcus 속은 glucose 함량을 1%로 높인 한천배지에 접종하여 잘 혼합하였고, Bifidobacterium 속은 BL 한천배지에 접종하여 도말한 후 혐기성 상자(BBL Gas Pak Anaerobic System)에 넣고 37℃에서 48 시간 배양한 후 생성된 집락수를 계측하고 그 평균 집락 수에 희석 배수를 곱하여 배양액 ml 당 생균수를 산출하였다. 시료의 pH는 pH meter를 이용하여 측정하였다.
자색의 MTT formazan이 생성되면 dimethylsulfoxide (DMSO) 150 ㎕를 첨가하고 10 분간 상온에서 용해시켜 ELISA reader를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 생존 세포율은 중복 측정된 3 회 반복실험의 평균값으로 제시하였다.
세포 독성 및 세포 생존률을 측정하기 위하여 자동 microplatereader spectrophotometer를 이용한 MTT 분석을 하였다. Huh7 cell을 96-well plate에 각각 1×10⁴ Cells/ml의 농도로 200 ㎕씩 분주 한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 세포를 적응시키고, 시료의 농도가 각각 0-200 μM / 200 ㎕이 되도록 조정한 후 (6개 농도), 200 ㎕씩 세포에 처리하였다.
시료 100μl에 4 mM DPPH 용액 0.8ml를 가한 후 10 분간 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가 대조구의 흡광도와의 백분율로 나타내었고, 각각의 활성을 %로 나타내었다.
시료는 증류수에 녹여 10 mg/ml로 희석하였으며, injection 직전에 MFS-13 (pore size 0.20 μm)으로 여과해 HPLC 분석을 하였다.
의 방법에 준하여 시료의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소 공여 효과로 측정하였다. 시료를 각각 1%, 5%, 10%, 25% 그리고 50%의 시료용액으로 만든 후 측정 시료로 사용하였다. 시료 100μl에 4 mM DPPH 용액 0.
생균수는 시료 1 ml를 멸균 생리식염수 9 ml에 희석하고 단계별로 희석 후 1 ml를 취하여 Lactobacillus 속과 Pediococcus 속은 glucose 함량을 1%로 높인 한천배지에 접종하여 잘 혼합하였고, Bifidobacterium 속은 BL 한천배지에 접종하여 도말한 후 혐기성 상자(BBL Gas Pak Anaerobic System)에 넣고 37℃에서 48 시간 배양한 후 생성된 집락수를 계측하고 그 평균 집락 수에 희석 배수를 곱하여 배양액 ml 당 생균수를 산출하였다. 시료의 pH는 pH meter를 이용하여 측정하였다.
열탕추출기 (대웅, Korea), rotary vacuum evaporator (Büchi B-480, Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540, Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo, Japan), micro-pipet (Gilson, France), water bath (Vision scientific Co., Korea), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimazue, Japan), centrifuge (Sigma, U.S.A.), deep-freezer (Sanyo, Japan), thermocycler system (MWG Biotech., Germany), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), homogenizer (OMNI, U.S.A), plate shaker (Lab-Line, U.S.A.) 및 ELISA reader (Molecular Devices, U.S.A.), pH meter (Horiba F-51, Japan), HPLC (Shimazu, Japan), C18역상 HPLC column (Hypersil, U.S.A.) 등을 사용하였다.
유산균을 MRS 액체배지를 이용하여 37℃에서 정치 배양하여 활성화하였다. 지황 시료를 5% 첨가하여 배지를 제조하고 멸균시킨 후 활성화된 유산균을 1% (1.
유산균을 MRS 액체배지를 이용하여 37℃에서 정치 배양하여 활성화하였다. 지황 시료를 5% 첨가하여 배지를 제조하고 멸균시킨 후 활성화된 유산균을 1% (1.0 X 10⁶CFU/ml) 씩 접종하여 48 시간 동안 배양하였고 배양 후 분석에 이용하였다.
혈당강하 실험은 α-glucosidase를 10 mM PIPES buffer에 용해시킨 10 μl 효소액, 20 mM maltose 40 μl, 각 농도의 발효액 10μl를 혼합해서 37℃에서 20 분간 반응시킨 후 1 ml DNS 시약을 첨가하고 100℃에서 10 분간 열처리한 후에 550 nm에서 흡광도를 측정하여 효소활성 저해율을 계산하였다23).

대상 데이터

전체 분석시간은 30 분으로 이동상의 구성은 초기 5 분 동안 H₂O를 흘려주었고, 이후 20 분 동안은 acetonitrile gradient를 하여 acetonitrile을 100%까지 올린 다음, 그 상태를 5 분간 지속하였다. 214 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 시료를 확인하였다.
Folin-Ciocalteu's phenol reagent, Na2CO3, gallic acid, potassium phosphate buffer pH 8.3, NaCl, hippuryl-his-leu (HHL, H-1635), rabbit lung acetone powder (L-0756), tetrazolium MTT salt (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), phenophathalein alcohol, potassium phosphate diabasic, potassium phosphate monobasic, sodium bicarbonate 등은 Sigma-Aldrich (U.S.A.) 제품을, trypsin-EDTA, D-PBS (dulbecco's phosphate buffered saline), antibiotic solution (penicillin streptomycin), nonessential amino acid, MEM 배지는 GIBCO BRL Life Technology (U.S.A.) 제품을, 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 hyclone (Logan, U.S.A.) 제품을, MRS 한천배지는 Difco (U.S.A.) 제품을, 그리고 SOD assay kit는 Dojindo (Japan)를 사용하였고, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
건지황의 수용성 성분을 분석하기 위하여 C₁₈역상 HPLC column을 장착한 HPLC를 사용하였다. 전체 분석시간은 30 분으로 이동상의 구성은 초기 5 분 동안 H₂O를 흘려주었고, 이후 20 분 동안은 acetonitrile gradient를 하여 acetonitrile을 100%까지 올린 다음, 그 상태를 5 분간 지속하였다.
본 실험에 사용한 건지황 (Rehmannia glutinosa Liboschitz)은 중국 하북 지역에서 생산되어 건조된 것으로 중국 안국시장에서 구입하였다.
본 연구에 사용한 세포주는 Huh7 간 (Liver) 세포를 사용하였다. Huh7 세포주는 10% v/v fetal bovine serum, 1% v/v antibiotic solution(penicillin streptomycin, 1% v/v nonessential amino acid, 그리고 sodium bicarbonate (Sigma, MO, Germany) 가 함유된 DMEM 배지로 배양하였다.

데이터처리

모든 실험 결과들은 평균값 ± 표준편차로 기록하였고 유의성 검증은 Student's T-test 분석방법을 이용하여 결정하였다.

이론/모형

SOD 유사활성은 Marklund와 Marklund의 방법²⁰⁾에 따라 과산화수소(H₂O₂)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol 생성량을 측정하여 SOD 유사활성을 측정하였다.
Huh7 cells were treated with Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix fermented for 48hr. The cell proliferation was measured by the MTT assay as described in materials and methods. Date are expressed as % of control and each column represents the mean±S.
시료의 전자공여능 측정은 Blois²¹⁾와 Lee 등²²⁾의 방법에 준하여 시료의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소 공여 효과로 측정하였다. 시료를 각각 1%, 5%, 10%, 25% 그리고 50%의 시료용액으로 만든 후 측정 시료로 사용하였다.

성능/효과

Huh7 세포주에 건지황과 발효지황을 0.1, 1, 10 μg/ml 농도로 48시간동안 배양한 후 Huh7 세포증식에 미치는 영향을 조사한 결과, 발효지황은 대조군 (건지황)에 비해 증식률이 각각 104.18±9.01%, 126.96±5.53%, 131.46±186%로 나타났다.
건지황 발효를 통해 유산균 증식률이 100배 이상인 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 이와 같은 결과는 건지황의 78%가 탄수화물이고, 이들 중 다당류를 제외한 발효 가능한 glucose, fructose, maltose, sucrose, galactose 등과 같은 단당류들의 양이약 14%가 존재하므로 발효에 필요한 탄소원으로 작용할 것으로 추정되고³⁴⁾, 생균체가 시간이 경과함에 따라 적응하여 생균수가 증가한 것으로 보이며, 건지황 내의 풍부한 무기질과 당이 균체 접종 후 발효기간 동안 균체의 생존율에 긍정적인 영향을 미친 것으로 생각된다.
건지황, 발효지황, 유산균에 대한 SOD 유사활성에 대해 농도 의존적 활성증가를 나타냈으며(Fig. 3), 발효지황이 건지황보다 SOD 유사활성이 우수한 것으로 나타났다. 한편 발효를 통해 저분자량의 polyphenol성 물질은 증가하게 되고 이로 인해 항산화력이 증가하였다는 연구³⁶⁾를 통해, 희석 후에도 일정 농도 범위에서 항산화 활성을 보이는 것은 건지황 고유의 높은 항산화 활성능력과 발효과정으로부터 얻어진 polyphenol 성분에 기인하는 것으로 여겨진다.
건지황과 발효지황의 DPPH 라디칼 소거능에 대하여 실험한 결과, 발효지황은 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 시료농도에서 각각 96.42±2.52%, 86.51±0.12%, 77.28±0.8%의 농도 의존적 활성을 나타내었다.
건지황과 발효지황의 SOD 유사활성 실험에서 발효지황은 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 시료농도에서 각각 38.21±1.1 %, 60.35±0.1%, 79.78±0.13%의 농도 의존적 활성증가를 나타내었다.
폴리페놀과 플라보노이드 화합물은 항산화를 나타내는 대표적인 화합물로서, 숙지황의 열처리에 따라 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물이 증가되는데³⁹⁾, 열처리에 의해 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 증가하는 원인은 건지황 및 숙지황의 세포벽이 파괴되어 불용성 성분으로부터 폴리페놀 성분이 유리되기 때문이라 판단되며, 또한 열처리 및 가공과정 중에 항산화력을 가지고 있는 maillard reaction products 생성, 단백질 가수분해 등에 의하여 새로운 항산화 물질들이 형성되는 것으로 보고 있다⁴⁰⁾. 따라서 발효지황은 건지황의 새로운 생리활성 물질의 생성과 건지황이 가지고 있는 효능의 검증을 통해 발효지황의 우수성을 확인할 수 있었다.
한편 발효를 통해 저분자량의 polyphenol성 물질은 증가하게 되고 이로 인해 항산화력이 증가하였다는 연구³⁶⁾를 통해, 희석 후에도 일정 농도 범위에서 항산화 활성을 보이는 것은 건지황 고유의 높은 항산화 활성능력과 발효과정으로부터 얻어진 polyphenol 성분에 기인하는 것으로 여겨진다. 발효지황에 대한 DPPH에 대한 결과에도 농도 의존적인 활성을 나타냈으며, 발효지황과 건지황은 전자공여능이 유사한 것으로 나타났다(Fig. 3). 다만 발효지황, 건지황, 유산균 간의 차이가 없어서 발효지황의 효능이 상대적으로 우수하다고 할 수는 없었다.
본 실험에서 HPLC를 통하여 건지황과 발효지황의 성분을 비교한 결과, 건지황은 3 분에서 peak를 나타냈고, 발효지황은 5분을 전후로 하여 peak를 나타냈는데, 이는 유산균을 통한 발효지황이 성분상에 변화를 초래했음을 의미한다(Fig. 1). 일반적으로 유산균 발효 중 pH가 급격히 감소하는 것은 유산균 발효과정에서 생성되는 젖산 및 여러 가지 유기산의 생성에 기인하는 것으로 알려져 있다³¹⁾.
음성 대조군인 유산균은 0.1㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 시료농도에서 각각 95.98±0.37%, 84.37±1.89%, 68.39±1.51%의 농도 의존적 활성증가를 나타내었다(Fig. 3-B).
이상의 결과로 볼 때 발효지황은 건지황에 비하여 항산화, 혈압강하, 혈당강하에 효과가 있는 것으로 나타났다. 이는 발효지황이 생리활성에 효과가 있음을 시사하며, 포제법의 변화가 약효에 영향을 준다는 한의학 이론을 실험적으로 입증하였다. 향후 단일 균주 탐색 및 단일균주와 복합균주의 병용 연구를 통하여 발효지황 제조에 가장 적합한 유산균주 및 최적 공정을 탐색해야 할 것이다.
이상의 결과로 볼 때 발효지황은 건지황에 비하여 항산화, 혈압강하, 혈당강하에 효과가 있는 것으로 나타났다. 이는 발효지황이 생리활성에 효과가 있음을 시사하며, 포제법의 변화가 약효에 영향을 준다는 한의학 이론을 실험적으로 입증하였다.
혈당강하 기능검색을 위한 기질로서 maltose와 건지황 추출물을 첨가하여 추출물에 의한 효소 활성을 검색한 결과, 발효지 황은 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml의 시료농도에서 각각 92.36±3.54%, 90.11±1.37%, 89.14±2.4%의 농도 의존적 저해 활성을 나타내었다.
특히 식품의 생체 조절 기능에서 혈압상승 원인 중에 하나인 ACE에 대해 저해작용이 있다는 것이 알려지면서 이에 관해 많은 연구가 진행되고 있다³⁷⁾. 혈압강하 기능 검색을 위해 효소 활성 억제 실험에서도 본 연구는 농도 의존적인 활성 억제를 나타내었다(Fig. 5).
혈압강하 기능검색을 위해 건지황 및 발효 지황 추출물을 첨가하여 추출물에 의한 효소 활성 억제율을 실험한 결과, 건지 황은 0.2 ㎍/ml, 0.4 ㎍/ml, 0.6 ㎍/ml, 0.8 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 시료 농도에서 각각 19.02±3.18%, 20.42±2.98%, 23.46±2.88%, 30.98±2.52%, 35.12±2.8 %의 농도 의존적인 활성 저해를 나타내었다.

후속연구

이는 발효지황이 생리활성에 효과가 있음을 시사하며, 포제법의 변화가 약효에 영향을 준다는 한의학 이론을 실험적으로 입증하였다. 향후 단일 균주 탐색 및 단일균주와 복합균주의 병용 연구를 통하여 발효지황 제조에 가장 적합한 유산균주 및 최적 공정을 탐색해야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	포제란?	포제는 약의 정선과 약성의 변화를 일으켜 환부에 따라 약력을 강화하거나 약화하기 위하여 법제하는 것을 말한다1). 지황은 포제방법에 따라, 신선한 뿌리를 생지황 (鮮地黃, Rehmanniae Radix Crudes)이라 하여 淸熱滋陰, 凉血止血, 養陰生津, 止渴의 효능이 있고, 그대로 말린 것을 건지황 (Rehmanniae Radix)이라 하여 淸熱凉血, 養陰生津의 효능이 있으며, 뿌리를 포제 가공한 것을 숙지황 (Rehmanniae Radix preparata)이라고 하여 補血滋陰, 益精塡髓의 효능이 있다10).
	최근 발효 식품은 생리 활성 작용이 알려지면서 세계적으로 건강 기능성 장수식품으로서 인식되는데 특히 무엇이 당류를 발효하여 젖산을 생성하는 세균으로 위장기능 개선, 체내 콜레스테롤 흡수 저해, 면역조절, 영양소의 흡수 및 이용률을 높이는 등 다양한 질병 예방효과와 생리 조절 작용을 하는가?	최근 발효 식품은 생리활성 작용이 알려지면서 세계적으로 건강기능성 장수식품으로서 인식되고 있고 특히 Lactobacilli 및 Bifidobacterium과 같은 유산균은 당류를 발효하여 젖산을 생성하는 세균으로 위장기능 개선, 체내 콜레스테롤 흡수저해, 면역조절, 영양소의 흡수 및 이용률을 높이는 등 다양한 질병 예방효과와 생리조절 작용을 하는 것으로 밝혀진 건강기능성 식품소재이다16-18). 한방 약물은 일반적으로 경구 투여되면 우선 장내 미생물에 의하여 대사되어질 수 있고, 장내 미생물에 의한 유효성분이 약효성분으로 대사변환 또는 흡수를 촉진시킬 가능성도 매우 높다고 할 수 있다19).
	당뇨병 치료방법 중 탄수화물의 소화 분해를 억제함으로써 혈액 속에 당의 농도를 조절하는 방법이 있는데, 이때 탄수화물은 무엇에 의해 포도당이 분해되어 흡수되는가?	당뇨병 치료방법 중 탄수화물의 소화 분해를 억제함으로써 혈액 속에 당의 농도를 조절하는 방법이 있다. 탄수화물은 주로 소장점막에서 분비되는 α-glucosidase에 의해 포도당으로 분해되어 흡수되는데 이 α-glucosidase의 활성을 조절하면 식후의 급격한 혈당상승을 억제할 수 있다. 식후 혈당을 효과적으로 조절할수 방법의 하나로 음식물 중의 탄수화물의 소화를 지연시켜 소장으로부터의 흡수를 방해하는 연구가 보고되었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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