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문제 정의
- Alkaline phosphatase(ALP) 효소는 간이나 신장 등의 기능에 이상이 있을 시 혈중에 이 효소가 증가된다고 보고되었으며,24,25) 본 연구에서는 고콜레스테롤혈증 유발과 산마늘 추출물의 투여가 실험동물의 간 등의 기능에 미치는 영향을 알아보기 위한 지표로 이 효소의 활성을 측정하였다. 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼의 혈중 ALP 활성은 지속적으로 증가하였으나 산마늘 추출물을 투여한 토끼의 ALP의 활성은 시험 시작시와 변화가 없는 것으로 나타났다.
- 산마늘은 예로부터 강장 및 생리장애 완화효과와 해독작용이 있는 것으로 전해 왔으며,13)특히 산마늘의 에탄올 추출물은 in vitro에서 섬광근접분석방법(scintillation proximity assay)을 이용한 CETP 효소활성 저해도 측정실험에서 높은 CETP 억제활성을 나타내었다(81% 이상, unpublished). 본 연구에서는 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼와 CETP 형질전환 마우스에 산마늘 추출물을 투여하여 여러가지 동맥경화성 변수에 미치는 영향을 살펴봄으로서 산마늘 추출물의 항동맥경화성 효능을 관찰하고자 하였다.
- 연구가 많이 되지 않고 있는 실정이다. 이에 본연구에서는 백합과 다년초 식물의 일종인 산마늘(Allium victorialis Makino)의 항동맥경화성 효능에 대하여 시험하였다. 산마늘은 동북아시아 지역에 분포하고 있으며 우리 나라에서는 주로 울릉도 및 강원도 북부 산간의 고산지대에서 많이 자라고 있다.
제안 방법
- 05 g씩 섞어 투여하였다. CETP 형질전환 마우스는 고콜레스테롤 식이를 30일간 섭취시킨 후 0.5%(v/w) 산마늘 추출물을 첨가한 고콜레스테롤 펠렛사료를 이후 40일 동안 섭취시키면서 매 10일마다 마우스의 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 분석하였다.
- 8,14) 이후 토끼를 12시간 절식시키고 귀정맥에서 채혈하여 혈중 콜레스테롤 농도가 1,000 mg/dl 이상으로 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼를 선별하여 시험에 사용하였다. CETP 형질전환 마우스는 정상 식이용 마우스 분말사료 (퓨리나 1호)에 1% 콜레스테롤, 0.3% sodium cholate와 5% lard를 섞은 후 펠렛 형태로 제조하여 30일간 섭취시켰다. 이후 마우스의 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 고콜레스테롤혈증 유발을 확인한 후 시험에 사용하였다.
- 이 반응액을 실온으로 식혀 500×g에서 15분간 원심분리한 다음 상층액을 취하여 535nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA 표준용액은 TMP를 가수분해하여 조제하였으며 이를 혈장과 동일한 조건에서 반응시켜 TBA-MDA chromopore 표준곡선을 얻고, 이 곡선으로부터 TBA 반응물질의 양을 MDA equivalent로 산출하였다.
- 고콜레스테롤 혈증이 유발된 토끼와 CETP 형질전환 마우스에 산마늘 추출물을 투여하고 혈액과 조직의 동맥경화성 변수들을 측정하여 항동맥경화성 효능을 살펴보았다. 산마늘 추출물의 투여는 토끼의 혈액과 조직에서 지질과 과산화지질의 농도를 낮추었고 대동맥 내벽에 동맥경화증의 지표인 plaque 형성을 억제하였고, CETP 형질전환 마우스의 혈액과 조직의 지질 농도를 유의하게 낮추었다.
- 고콜레스테롤혈증 유발 - 토끼는 2주간의 순화기간동안 펠렛사료 (육성용, 신촌사료)를 분쇄한 분말사료에 적응하게 하였고, 동맥경화증 유발을 위해서 분말사료에 1%의 콜레스테롤 0.3%의 sodium cholate를 섞은 고콜레스테롤 식이 (high cholesterol diet, HCD)를 30일간 섭취시켰다.8,14) 이후 토끼를 12시간 절식시키고 귀정맥에서 채혈하여 혈중 콜레스테롤 농도가 1,000 mg/dl 이상으로 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼를 선별하여 시험에 사용하였다.
- 대동맥의 지질침착정도 분석 - 실험 종료후 부검한 토끼의 대동맥(aorta)을 적출하여 생리식염수로 씻어 동맥주위의 지방질을 제거한 후 고정액(4% paraformaldehyde, 50 mM phosphate buffered saline (PBS),pH 7.4)에 24시간 고정시켰다. 고정된 동맥은 20% sucrose 용액에 침적시킨 후 보관액 (30% glycerin, 30% ethylene glycol in 20 mM phosphate buffer pH 7.
- 수 있는 마늘과는 다른 것이다. 또한, 본 실험에서는 뿌리뿐만 아니라 산마늘의 지상부를 포함하는 전초를 사용하였다. 산마늘의 일반 성분은 수분 77.
- 이후 85% propylene glycol 용액에 1분간 감별시키고 증류수로 두 번 세척한 후 ploymounts. 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.20)
- 산마늘 추출물 투여 -고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼는 혈중 콜레스테롤 농도를 기준으로하여 무작위로 산마늘 추출물 투여군, 양성대조군, 대조군으로 분리하였다. 산마늘 추출물 투여군은 이후 30일 동안 0.
- 산마늘 추출물 투여군은 이후 30일 동안 0.5%(v/w) 산마늘 추출물을 고콜레스테롤 분말식이에 섞어 투여하였으며, 매 10일마다 토끼의 귀정맥에서 채혈하여 혈장을 분석하였다. 양성 대조군에는 콜레스테롤 저하제로 잘 알려져 있는 lovastatin을 사료 kg당 0.
- 5%(v/w) 산마늘 추출물을 고콜레스테롤 분말식이에 섞어 투여하였으며, 매 10일마다 토끼의 귀정맥에서 채혈하여 혈장을 분석하였다. 양성 대조군에는 콜레스테롤 저하제로 잘 알려져 있는 lovastatin을 사료 kg당 0.05 g씩 섞어 투여하였다. CETP 형질전환 마우스는 고콜레스테롤 식이를 30일간 섭취시킨 후 0.
- TG의 농도도 87mg/d/에서 135mg/dl로 높아져 고콜레스테롤혈증이 유발되었다. 이후 시험물질을 첨가한 고콜레스테롤 식이를 30일 동안 섭취시키면서 혈액의 동맥경화성 변수들을 살펴보고 실험종료 후 간과 심장조직의 지질 농도를 측정하였다. 실험기간 동안에 토끼의 체중의 감소는 관찰되지 않았다(data not shown).
- 조직지질 분석 - 실험종료 12시간 전에 모든 군의 토끼를 절식시킨 후 300 ㎎/㎏ ketamine hydrochloride# 복강내 주사하여 마취시키고 간과 심장조직을 적출하였다. 조직을 생리식염수로 씻어 혈액을 제거한 후 lg을 달아 10 ml의 완충액 (0.
대상 데이터
- 3%의 sodium cholate를 섞은 고콜레스테롤 식이 (high cholesterol diet, HCD)를 30일간 섭취시켰다.8,14) 이후 토끼를 12시간 절식시키고 귀정맥에서 채혈하여 혈중 콜레스테롤 농도가 1,000 mg/dl 이상으로 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼를 선별하여 시험에 사용하였다. CETP 형질전환 마우스는 정상 식이용 마우스 분말사료 (퓨리나 1호)에 1% 콜레스테롤, 0.
- 시약 및 기기 -식이용 콜레스테롤, sodium cholate, lard는 TEKLAD사 (미국), lovastatine 중외제약, ketamine hydrochloride는 유한양행의 제품을 사용하였으며, triglyceride (TG) 측정 kit, 총콜레스테롤측정 kit, high density lipoprotein (HDL)-콜레스테롤 측정 kit, alkaline phosphatase (ALP) 활성 측정 kit, thiobarbituric acid (TBA), malondialdehyde (MDA), trichloroacetic add (TCA), teteamethoxypropane (TMP) 및 oil red 0 dye는 Sigma사 (미국)의 제품을 사용하였고, 그 외의 시약은 시판 특급 혹은 일급시약을 사용하였다. Spectrophotometer는 Molecular Devices사 (미국)의 SPECTRAmax 190모델을 사용하였으며, polytron homogenizer는 Janke & Kunkel사 (독일)의 Ultra-turrax T25모델을 사용하였다.
- 실험동물 - 토끼는 삼육실험동물농장(오산, 경기도)으로부터 구입한 2.2 ~ 2.6 kg의 수컷 New Zealand White종을, CETP 형질전환 마우스 (C57BL/6 UCTP-20)는12) 대전 생명공학연구소 유전자 자원 센터에서공급받아 사용하였다. 사육조건은 온도 23±1℃, 상대습도 55±5%, 명암교대 12시간으로 하였고, 물과 사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하였다.
- 실험재료 - 본 실험에 사용한 산마늘은 울릉도에서 채집한 전초를 실내에서 건조시키고 추출을 위해 Wiley mill을 사용하여 40~60 mesh로 분쇄하였다. 분쇄된 전초를 실온에서 시료 부피의 3배 용량의 에탄올에 72시간 침적한 후 연속하여 S회 추출하고 추출액은 rotary evaporator에서 추출액 부피의 5%까지 진공 농축시킨 후 4℃에 보관하여 사용하였다.
- 3% sodium cholate와 5% lard를 섞은 후 펠렛 형태로 제조하여 30일간 섭취시켰다. 이후 마우스의 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 고콜레스테롤혈증 유발을 확인한 후 시험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계학적 분석 - 모든 시험결과는 mean±S.E로 표기하였으며, Kruskal-Whllis one way analysis of variance (ANOVA)를 사용하여 통계처리 하였고, 각군간의 차이를 비교할 경우에는 Bonferroni's modified t- test를 사용하여 P<0.05 혹은 P<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.21)
이론/모형
- 분쇄된 조직균질액은 10배 용량의 chloroform/methanol 용액 (2 : 1, v/v)에 넣어 조직내 전체 지질을 추출하였다. 2차 추출은 Folch 방법19)을 사용하였으며, 추출된 지질은 질소 gas로 말린 다음 isopropyl alcohoH 다시 녹인 후 총 콜레스테롤 농도와 triglyceride 농도를 전술된 방법으로 측정하였다.
- 이용하여 계산하였다. ALP의 활성은 kinetic 방법17)을 이용하여 측정하였다.
- add (TCA), teteamethoxypropane (TMP) 및 oil red 0 dye는 Sigma사 (미국)의 제품을 사용하였고, 그 외의 시약은 시판 특급 혹은 일급시약을 사용하였다. Spectrophotometer는 Molecular Devices사 (미국)의 SPECTRAmax 190모델을 사용하였으며, polytron homogenizer는 Janke & Kunkel사 (독일)의 Ultra-turrax T25모델을 사용하였다.
- 혈장 지질과산화 상태 측정 - 혈장 과산화물 측정에 있어서는 Gutteridge의 방법18)을 적용하여 TBA반응으로 형성되는 MDA를 정량하였다. 혈장 50μl에 5% TCA 용액 300μl와 60 mM TBA 100μl를 넣어 잘 혼합한 후, 80℃ 수조에서 90분간 가열하였다.
- 혈장지질분석 -TG는 glycerol oxidase를 이용한 효소법으로, 총콜레스테롤은 cholesterol oxidase를 이용한 효소법으로, 그리고 HDL-콜레스테롤은 phosphotungstic acid-MgCl2 침전법15)을 이용한 kit를 이용하여 정량하였으며, 토끼의 LDL-콜레스테롤은 Frid- wald식16)을 이용하여 계산하였다. ALP의 활성은 kinetic 방법17)을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 2)부검을 통한 연구 결과에서 보면 동맥경화는 소아기 시절부터 이미 생기기 시작하고,6) 사춘기에 급속히 증가하기 시작하여 이후 계속 진행하면서 여러 위험인자에 의해 동맥경화증의 발생이 가속화된다.7) 동맥경화증에 대한 연구는 고콜레스테롤혈증과 여러 위험인자들의 복잡한 반응에 의한 동맥경화로의 진행을 차단하여 예방하자는 것이 주목적인데 현재의 의학 수준에서 모두 제거하지는 못하는 실정이다.
- 22) 동맥경화증의 가장 중요한 병인은 고콜레스테롤혈증이며 그 중에서도 LDL-콜레스테롤 농도가 높을수록 동맥경화증이 쉽게 유발된다.3) 혈액에서 콜레스테롤 (혹은 다른 지질들)을 운반하는 지단백질 대사 경로의 복 잡한 과정들은 크게 세포의 콜레스테롤 수요를 충족시키는 경로와 세포에서 사용하고 남은 콜레스테롤을 수거하여 제거하는 경로로 나눌 수 있다.
- 22) 동맥경화증의 가장 중요한 병인은 고콜레스테롤혈증이며 그 중에서도 LDL-콜레스테롤 농도가 높을수록 동맥경화증이 쉽게 유발된다.3) 혈액에서 콜레스테롤 (혹은 다른 지질들)을 운반하는 지단백질 대사 경로의 복 잡한 과정들은 크게 세포의 콜레스테롤 수요를 충족시키는 경로와 세포에서 사용하고 남은 콜레스테롤을 수거하여 제거하는 경로로 나눌 수 있다. 이 중 후자를 콜레스테롤 역수송(reverse cholesterol transport)경로라고 부르며,23)이 과정에서 CETP 효소는 HDL의 콜레스테롤을 LDL로 옮기는 작용을 한다.
- 05). ALP의 활성은 감소하는 경향을 나타내었으나 통계적인 유의성은 없었고, 혈장지질의 과산화 정도를 malondialdehyde (MDA)의 농도로 측정하였을 때 유의하게 51.7% 감소되었다 (대조군: 5.6±1.3nmol/ml, 투여군: 2.7±0.4nmol/ml, P<0.05). 한편 양성대조군인 lovastatin 투여군에서는 강력한 혈중 지질 강하효과가 관찰되었다.
- 01). HDL-콜레스테롤의 농도는 변화가 없었으며, TG 농도는 유의하게 22.1% 감소하는 것으로 나타났다 (대조군: 172±24mg/dl, 투여군: 134±12mg/dl, P<0.05). ALP의 활성은 감소하는 경향을 나타내었으나 통계적인 유의성은 없었고, 혈장지질의 과산화 정도를 malondialdehyde (MDA)의 농도로 측정하였을 때 유의하게 51.
- Alkaline phosphatase(ALP) 효소는 간이나 신장 등의 기능에 이상이 있을 시 혈중에 이 효소가 증가된다고 보고되었으며,24,25) 본 연구에서는 고콜레스테롤혈증 유발과 산마늘 추출물의 투여가 실험동물의 간 등의 기능에 미치는 영향을 알아보기 위한 지표로 이 효소의 활성을 측정하였다. 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼의 혈중 ALP 활성은 지속적으로 증가하였으나 산마늘 추출물을 투여한 토끼의 ALP의 활성은 시험 시작시와 변화가 없는 것으로 나타났다. 실험종료 후 토끼의 간과 심장조직의 지질함량을 살펴보았을 때 산마늘 추출물 투여군에서 콜레스테롤의 농도가 감소된 것으로 나타났으며 (Table Ⅱ), 대동맥을 적출하여 지질을 염색하였을 때 산마늘 추출물을 투여한 토끼의 대동맥 내벽에 지질 침착이 감소된 것으로 나타났다(Fig.
- 1). 또한 CETP 형질전환 마우스 동물모델을 이용하여 산마늘 추출물의 항동맥경화성 효능을 관찰한 결과, 혈중 콜레스테롤과 TG의 농도감소와 (Table Ⅲ) 조직의 지질 함량을 감소시키는 것으로 나타났다 (Table Ⅳ). 이러한 혈중 지질과 과산화지질 농도의 감소 효과를 양성대조군인 lovastatin 투여군과 비교하였을 때, 본 실험에 사용된 산마늘이 1차 추출물임을 감안하면 혈증 지질의 농도저하 효과가 상당히 높은 약리활성 물질이 함유되어 있으리라 사료된다.
- 1, panel B). 산마늘 추출물 투여군(Fig. 1, panel C)에서는 침착된 atheromatous plaque의 형성이 현저히 줄어들었으며, 양성대조군인 lovastatin 투여군(Fig. 1, panel D)에서도 지질침착 감소가 관찰되었다.
- 산마늘 추출물을 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼에 투여하였을 때 혈중 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, TG의 농도감소와 ALE의 활성감소와 과산화지질의 농도의 감소가 관찰되었다 (Table I). Alkaline phosphatase(ALP) 효소는 간이나 신장 등의 기능에 이상이 있을 시 혈중에 이 효소가 증가된다고 보고되었으며,24,25) 본 연구에서는 고콜레스테롤혈증 유발과 산마늘 추출물의 투여가 실험동물의 간 등의 기능에 미치는 영향을 알아보기 위한 지표로 이 효소의 활성을 측정하였다.
- 살펴보았다. 산마늘 추출물의 투여는 토끼의 혈액과 조직에서 지질과 과산화지질의 농도를 낮추었고 대동맥 내벽에 동맥경화증의 지표인 plaque 형성을 억제하였고, CETP 형질전환 마우스의 혈액과 조직의 지질 농도를 유의하게 낮추었다.
- 산마늘 투여군에 있어서는 간 조직의 총콜레스테롤 (대조군: 53.4±6.6mg/g, 투여군: 29.3±1.8 mg/ g, P<0.05) 및 TG 함량 (대조군: 20.6±3.4mg/g, 투여군: 12.5±1.1 mg/g, P＜0.05)의 유의성 있는 감소가 관찰되었다. 심장조직에서는 총콜레스테롤 함량은 유의성 있게 감소되었으나 (대조군: 16.
- 제시하였다. 산마늘 투여군에서 혈중 총콜레스테롤 농도는 투여 30일째에 대조군에 비해 유의하게 20.8% 감소하였고 (대조군: 1373± 38 mg/dl, 투여군: 1087± 48 mg/dl, P<0.01), LDL-콜레스테롤 농도는 유의하게 21.8% 감소하였다 (대조군: 1293+36 mg/dZ, 투여군: 1010±49 mg/dl, P<0.01). HDL-콜레스테롤의 농도는 변화가 없었으며, TG 농도는 유의하게 22.
- CETP 형질전환 마우스에서 산마늘 추출물의 투여가 혈장 지질 및 ALP 활성도에 미치는 영향을 보여주며, Table Ⅳ는 마우스의 간과 심장조직에서 지 질의 함량에 미치는 영향을 보여주고 있다. 산마늘 투여군에서 혈중 총콜레스테롤 농도는 투여 40일째에 대조군에 비해 9.4% 감소하였으며(대조군: 235.9±31.3mg/dl, 투여군: 213.8±20.9 mg/dl, P<0.05), HDL -콜레스테롤이나 TG의 농도에 있어서는 변화가 관찰되지 않았다. 한편 ALP의 활성은 유의하게 48.
- 01). 실험종료 후 CETP 형질전환 마우스의 간 조직을 분석한 결과 총콜레스테롤과 TG 함량은 감소하는 경향을 나타내었으나 유의성이 없었고, 심장조직의 TG 함량은 유의성 있게 63.7% 감소하였다(대조군: 39.1 ±9.8mg/g, 투여군: 14.2±0.9mg/g, P<0.01).
- 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼의 혈중 ALP 활성은 지속적으로 증가하였으나 산마늘 추출물을 투여한 토끼의 ALP의 활성은 시험 시작시와 변화가 없는 것으로 나타났다. 실험종료 후 토끼의 간과 심장조직의 지질함량을 살펴보았을 때 산마늘 추출물 투여군에서 콜레스테롤의 농도가 감소된 것으로 나타났으며 (Table Ⅱ), 대동맥을 적출하여 지질을 염색하였을 때 산마늘 추출물을 투여한 토끼의 대동맥 내벽에 지질 침착이 감소된 것으로 나타났다(Fig. 1). 또한 CETP 형질전환 마우스 동물모델을 이용하여 산마늘 추출물의 항동맥경화성 효능을 관찰한 결과, 혈중 콜레스테롤과 TG의 농도감소와 (Table Ⅲ) 조직의 지질 함량을 감소시키는 것으로 나타났다 (Table Ⅳ).
- 이 중 후자를 콜레스테롤 역수송(reverse cholesterol transport)경로라고 부르며,23)이 과정에서 CETP 효소는 HDL의 콜레스테롤을 LDL로 옮기는 작용을 한다. 이러한 작용의 결과로 HDL을 통해 간으로 전달되어 체외로 배출되어야 할 콜레스테롤은 LDL로 전달되어 혈중에서 효과적으로 제거되지 못하고 동맥경화증의 병인으로 작용하므로 CETP는 동맥경화 유발인자(atherogenic factor)로 작용한다.9) 이와 같은 배경을 바탕으로 새로운 개념의 동맥경화 치료제를 개발하기 위해 CETP 효소활성 억제제 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
- 토끼 혈장 분석 -토끼에 고콜레스테롤 식이를 30일 동안 섭취시켰을 때, 혈중 콜레스테롤 농도는 섭취전 60mg/dl에서 급속히 증가하여 1284mg/di로 높아졌으며, TG의 농도도 87mg/d/에서 135mg/dl로 높아져 고콜레스테롤혈증이 유발되었다. 이후 시험물질을 첨가한 고콜레스테롤 식이를 30일 동안 섭취시키면서 혈액의 동맥경화성 변수들을 살펴보고 실험종료 후 간과 심장조직의 지질 농도를 측정하였다.
후속연구
- 본 연구결과에서 산마늘은 혈액과 조직에서 동맥경화의 병인인 지질과 과산화지질의 농도를 낮추는 것으로 나타났으며, 이러한 작용을 나타내는 약리활성물질의 확인과 기전을 밝히기 위하여는 좀 더 심도있는 연구가 수행되어야 할 것이다.
- 또한 CETP 형질전환 마우스 동물모델을 이용하여 산마늘 추출물의 항동맥경화성 효능을 관찰한 결과, 혈중 콜레스테롤과 TG의 농도감소와 (Table Ⅲ) 조직의 지질 함량을 감소시키는 것으로 나타났다 (Table Ⅳ). 이러한 혈중 지질과 과산화지질 농도의 감소 효과를 양성대조군인 lovastatin 투여군과 비교하였을 때, 본 실험에 사용된 산마늘이 1차 추출물임을 감안하면 혈증 지질의 농도저하 효과가 상당히 높은 약리활성 물질이 함유되어 있으리라 사료된다.
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