구상나무로부터 추출된 정유가 개발되어 있지만, 피부와 연관된 연구 관점에서 효능이 아직까지 밝혀지지 않았다. 본 연구의 목적은 B16F10 흑색종 세포(B16F10)와 인간 피부아세포주(HDF)에서 멜라닌과 주름 형성 상의 구상나무 추출물 효과를 알아보는데 있다. 정유는 수첨 증류법으로 추출하였고 무수 황산나트륨으로 정제 하였다. $10^{-5}$배의 정유농도에서, 두 세포의 생존능은 세포독성 평가에 의해 확인 되었다. B18F10의 항멜라닌 효과는 티로시나아제 억제 분석과 티로시나아제, 티로시나아제 연관 단백질 -1과 -2(TRP-1, TRP-2)의 유전자 발현 검증을 통해 이루어졌다. 정유는 알파-멜라닌세포 자극 호르몬 유도 그룹과 비교하여 티로시나아제 억제 활성이 5배, 아르부틴 유도 그룹과 비교하였을 때 30% 정도 감소되었다. 3가지 멜라닌 유래 인자들의 mRNA 수준도 각각 증가하였다. 항주름 효과를 분석하기 위해, 프로콜라겐 타입 I c 펩티드 합성(PIP) 분석과 웨스턴 블록을 수행하였다. 정유를 처리한 그룹에서 PIP가 증가되었고 콜라겐 타입 1과 기질 금속 단백질 분해 효소가 개선 되었다. 또한 정유는 $60mJ/cm^2$의 자외선 조건에서, 자외선-억제 콜라겐 타입 1의 증가와 기질 금속 단백질 분해 효소 생성 억제를 통해 항주름 효과를 보여줬다. 따라서 구상나무 추출물은 미백과 항주름을 위한 안전하고 효과적인 피부 제재로서 가능성을 가지고 있음을 암시한다.
구상나무로부터 추출된 정유가 개발되어 있지만, 피부와 연관된 연구 관점에서 효능이 아직까지 밝혀지지 않았다. 본 연구의 목적은 B16F10 흑색종 세포(B16F10)와 인간 피부아세포주(HDF)에서 멜라닌과 주름 형성 상의 구상나무 추출물 효과를 알아보는데 있다. 정유는 수첨 증류법으로 추출하였고 무수 황산나트륨으로 정제 하였다. $10^{-5}$배의 정유농도에서, 두 세포의 생존능은 세포독성 평가에 의해 확인 되었다. B18F10의 항멜라닌 효과는 티로시나아제 억제 분석과 티로시나아제, 티로시나아제 연관 단백질 -1과 -2(TRP-1, TRP-2)의 유전자 발현 검증을 통해 이루어졌다. 정유는 알파-멜라닌세포 자극 호르몬 유도 그룹과 비교하여 티로시나아제 억제 활성이 5배, 아르부틴 유도 그룹과 비교하였을 때 30% 정도 감소되었다. 3가지 멜라닌 유래 인자들의 mRNA 수준도 각각 증가하였다. 항주름 효과를 분석하기 위해, 프로콜라겐 타입 I c 펩티드 합성(PIP) 분석과 웨스턴 블록을 수행하였다. 정유를 처리한 그룹에서 PIP가 증가되었고 콜라겐 타입 1과 기질 금속 단백질 분해 효소가 개선 되었다. 또한 정유는 $60mJ/cm^2$의 자외선 조건에서, 자외선-억제 콜라겐 타입 1의 증가와 기질 금속 단백질 분해 효소 생성 억제를 통해 항주름 효과를 보여줬다. 따라서 구상나무 추출물은 미백과 항주름을 위한 안전하고 효과적인 피부 제재로서 가능성을 가지고 있음을 암시한다.
The essential oil from Abies koreana E.H. Wilson had been developed, however, its efficacy has not yet been studied especially in terms of skin care research. The aim of this study is to investigate the effects of Abies koreana extracts (AKE) on melanogenesis and wrinkle formation in B16F10 melanoma...
The essential oil from Abies koreana E.H. Wilson had been developed, however, its efficacy has not yet been studied especially in terms of skin care research. The aim of this study is to investigate the effects of Abies koreana extracts (AKE) on melanogenesis and wrinkle formation in B16F10 melanoma cells (B16F10) and human dermal fibroblast cell line (HDF). The essential oil was extracted by hydrodistillation method and purified by anhydrous sodium sulfate. At a concentration of $10^{-5}$-fold, viability in these cells had been defined by cytotoxicity assays. Anti-melanogenic effects on B16F10 were evaluated using tyrosinase inhibition assay, and real-time PCR for verifying gene expression of tyrosinase, tyrosinase related protein-1 and -2 (TRP-1 and -2). AKEs reduced about 5-fold of tyrosinase inhibitory activity compared to ${\alpha}$-melanocyte-stimulating hormone (${\alpha}$-MSH)-induced group and about 30% reduction compared to Arbutin induced group. The mRNA levels of three melanin-related factors were increased, separately. To investigate the effects of anti-wrinkle, procollagen type I c peptide synthesis assay (PIP) and Western blot were performed. At AKE-treated group, PIP was up-regulated and the expression of collagen type 1 and matrix metalloproteinase (MMP)-1 were improved. Furthermore, AKE presented anti-wrinkle effects by increasing UVB-inhibited collagen type 1 expression, and reducing UVB-induced MMP-1 production at $60mJ/cm^2$ of UVB radiation. Therefore, Abies koreana extracts has potentials as a safe and an effective skin ingredient for whitening and anti-wrinkle.
The essential oil from Abies koreana E.H. Wilson had been developed, however, its efficacy has not yet been studied especially in terms of skin care research. The aim of this study is to investigate the effects of Abies koreana extracts (AKE) on melanogenesis and wrinkle formation in B16F10 melanoma cells (B16F10) and human dermal fibroblast cell line (HDF). The essential oil was extracted by hydrodistillation method and purified by anhydrous sodium sulfate. At a concentration of $10^{-5}$-fold, viability in these cells had been defined by cytotoxicity assays. Anti-melanogenic effects on B16F10 were evaluated using tyrosinase inhibition assay, and real-time PCR for verifying gene expression of tyrosinase, tyrosinase related protein-1 and -2 (TRP-1 and -2). AKEs reduced about 5-fold of tyrosinase inhibitory activity compared to ${\alpha}$-melanocyte-stimulating hormone (${\alpha}$-MSH)-induced group and about 30% reduction compared to Arbutin induced group. The mRNA levels of three melanin-related factors were increased, separately. To investigate the effects of anti-wrinkle, procollagen type I c peptide synthesis assay (PIP) and Western blot were performed. At AKE-treated group, PIP was up-regulated and the expression of collagen type 1 and matrix metalloproteinase (MMP)-1 were improved. Furthermore, AKE presented anti-wrinkle effects by increasing UVB-inhibited collagen type 1 expression, and reducing UVB-induced MMP-1 production at $60mJ/cm^2$ of UVB radiation. Therefore, Abies koreana extracts has potentials as a safe and an effective skin ingredient for whitening and anti-wrinkle.
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문제 정의
Zeng 외의 연구자들에 따르면, 본 연구 결과와 마찬가지로 60 mJ/ cm2에서 자외선 유도된 활성 산소종을 유도 할 수 있다고 보고 했다[25]. 따라서, 60 mJ/cm2 자외선 조사 상태에서 구상나무를 처리하였을 때 collagen type 1의 발현이 조절되는 지 확인해 보았다(Fig. 5B). 자외선 조사를 하지 않은 위의 연구에서는 10-5 농도에서 의미 있는 결과를 도출한 반면, 자외선 조건하에 서는 10배 희석된 10-6 농도에서 발현이 개선된 것을 알 수 있었다(정상군 대비 약 50% 회복).
본 연구에서는 구상나무 추출물의 피부개선 효과를 확인하기 위해 미백 및 항주름 기능 관점에서 살펴보았다. 미백 효과를 측정하기 위해 tyrosinase 저해활성 억제 및 관련 세포신호 인자들의 발현을 확인하였고, 항주름 기능을 알아보기 위해 collagen 및 연관 단백질 분석을 실시하였다.
이에 본 연구에서는 천연 소재인 구상나무 추출물(Abies koreana extract, AKE)에 대한 미백 및 주름개선 효능을 평가하였고, 피부노화에 효과적인 새로운 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 보고하고자 한다.
제안 방법
정량된 20 μg/μl의 단백질을 Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel (SDS-PAGE)에 전기영동 시킨 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 옮겨 실온에서 1시간 blocking buffer [5% skin milk in Tris Buffered Saline with Tween-20 (TBST)]에서 배양하였다. 1차 항체 종일 보관 후 TBST로 3 회 세척하고, 2차 항체는 2시간 배양 후 TBST로 3회 세척하여 ECL detection reagents (AbClon, Seoul, Korea)를 이용하여 단백질 발현을 현상하였다.
B16F10 mouse melanoma 세포는 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) 배지로 각각 10% Fetal Bovine Serum (FBS)와 1% 항생제(penicillin-streptomycin)를 첨가하였다.
B16F10 mouse melanoma 세포와 HDF 세포를 이용해 CCK-8 assay (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan) 를 통한 추출물에 대한 세포성장 억제 활성효과를 확인하였다. 세포를 96-well plate 에 well 당 세포를 1×104씩 분주하고, 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양하였다.
항 주름과 관련된 연구에 사용한 세포는 인간 피부 섬유 아세포(human dermal fibroblast, HDF) 세포로 CEFOBIO (Seoul, Korea) 에서 구입하였다. HDF는 DMEM 배지로 각각 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 의 세포배양기에서 배양하였다.
혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 2번 세척하여 제거한 후, 10% CCK-8 solution 을 well 당 100 μl 처리하고 빛을 차단하여 90분 동안 37℃에서 반응시켰다. Microplate reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 450 nm에서 흡광값을 측정하여 세포의 생존율을 계산하였다.
Nuclease free water (NFW)를 20 μl 분주하여 녹인 후 RNA 양을 측정하였다.
이는 피부세포로부터 멜라닌 합성 정도를 확인 할 수 있는 세포 신호인자이다[17]. 구상나무 추출물이 멜라닌 합성 관련 유전자인 tyrosinase, TRP1, TRP2의 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위해 Real-time PCR로 유전자 발현을 확인하였다. Fig.
구상나무 추출물이 피부 관련세포, 즉 미백과 연관된 B16F10 melanoma 및 주름과 연관된 HDF, 에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 농도에 따른 생존율 측정을 하였다. 이를 위하여 구상나무 추출물의 농도는 10-2-10-6 까지 10배수의 범위에서 처리하였다.
2B). 또한, 구상나무 추출물 처리에 의해 HDF 에서 collagen type 1 발현에 미치는 영향을 알아보고자 구상 나무 추출물을 HDF 세포에 처치하고 48시간 뒤 면역 분석을 시행하였다. Fig.
본 연구에서는 구상나무 추출물의 피부개선 효과를 확인하기 위해 미백 및 항주름 기능 관점에서 살펴보았다. 미백 효과를 측정하기 위해 tyrosinase 저해활성 억제 및 관련 세포신호 인자들의 발현을 확인하였고, 항주름 기능을 알아보기 위해 collagen 및 연관 단백질 분석을 실시하였다. 이러한 결과는 구상나무 추출물이 피부 개선 더 나아가 피부 노화억제에 효과적일 것으로 판단된다.
배양접시에 담긴 배지를 제거한 후 PBS로 세척하고 plate의 덮개를 개방한 상태에서 UVB를 조사하였다. 이 때 자외선 B (Ultraviolet-B)는 UV-B lamp (Vilber Lourmat UV lamp, France)를 이용하여 60 mJ/cm2 의 강도로 30분간 조사하였다.
배지를 제거 후 PBS 로 세포를 2번 세척하고 TRIzol (Invitrogen, NY, USA)를 각 dish에 500 μl 분주하여 세포를 lysis 한 후 chloroform 200 μl를 분주하여 20초간 위아래로 흔들어 주었다.
본 실험에는 음성대조군 Arbutin 1 mg/ml과 양성대조군 α-MSH 250 nM을 사용하였으며 처리 후 48시간 이후 tyrosinase inhibition 측정을 실시하였다.
콜라겐의 부족 또는 결함은 피부 주름을 유발하며 이는 propeptide의 감소로부터 야기된다[22]. 본 연구에서는 HDF 에서 콜라겐 생합성 증가를 확인할 수 있는 pro-collagen type I C-peptide (PIP) enzyme immunoassay를 실시하였다. 구상나무 추출물의 콜라겐 생합성량 결과 양성대조군인 TGF-β 처리에 의한 생합성 보다는 낮지만 정상군 보다는 약 12% 개선된 PICP 생합성률을 보였다(Fig.
배양 후 배지를 모아 3,000 rpm, 3분 동안 원심분리 하여 상등액을 얻어 실험에 사용하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen type-I C peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio, Japan)을 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다.
시료에 존재하는 화합물들의 정량은 각 피크의 질량스펙트럼을 표준 라이브러리 및 표준물질의 것과 비교하여 정성한 다음 내부표준물질 피크의 면적과 목적 화합물 피크의 면적비율과 농도간의 직선적 상관성을 이용한 내부표준물질 정량법을 통하여 정량하였다.
시료에 존재하는 물질들 중 표준물질이 확보되지 않은 물질들의 정성은 시료의 TIC 에서 S/N 비율 100 이상의 피크들의 질량스펙트럼을 NIST 11 (National Institute of Standards and Technology, MD, USA) mass spectral library와 비교하여 수행하였다. 이 때 NIST library-search 프로그램의 match 값이 가장 높은 것을 선택하여 monoterpene류와 sesquiterpene류를 중점적으로 확인하였고 피크들의 retention time (RT)와 비교 확인된 화합물명을 목록화하였다.
배양접시에 담긴 배지를 제거한 후 PBS로 세척하고 plate의 덮개를 개방한 상태에서 UVB를 조사하였다. 이 때 자외선 B (Ultraviolet-B)는 UV-B lamp (Vilber Lourmat UV lamp, France)를 이용하여 60 mJ/cm2 의 강도로 30분간 조사하였다.
정유 성분 분석은 GC/MS 장비(Trace 1310/ISQ-LT, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 수행하였다. 컬럼은 DB-5MS 모세관 컬럼(길이 60 m, 내부직경 0.
정유(essential oil) 추출은 hydrodistillation 법으로 추출하였고, 10 l 둥근 플라스크에 1 kg의 잎과 증류수를 첨가하고 가열용 맨틀(MS-DM608 heating mantle, MTOPS®, Yangju, Korea)을 이용하여 가열하였으며, 가열 온도는 102±1℃로 설정하였다.
질량 스펙트럼은 EI-positive 스캔 범위 35-550 m/z로 0.2 scans·s-1의 속도로 total-ion chromatogram (TIC)를 획득하였다.
합성한 cDNA 와 2× SYBR green mix (TaKaRa, Japan), primer (Bioneer, Daejeon, Korea), ROX (TaKaRa) 를 각각 넣어 ABI step one plus (Thermo Fisher Scientific) 기기를 이용하여 95℃ 10분, 95℃ 3초, 60℃ 30초, 95℃ 15초, 60℃ 1분, 95℃ 15초(45 cycles)로 실시간 정량 분석을 한 뒤 분석 프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다.
미백과 관련된 연구에 사용된 세포는 B16F10 mouse melanoma 세포로 한국세포주연구재단(Seoul, Korea)에서 구입하였다. B16F10 mouse melanoma 세포는 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) 배지로 각각 10% Fetal Bovine Serum (FBS)와 1% 항생제(penicillin-streptomycin)를 첨가하였다.
본 실험의 공시재료인 구상나무는 광릉수목원 내에서 채취한 잎을 사용하였다. 채취한 잎은 곧바로 4℃ 이하에서 냉장 보관하였고, 잎과 잔가지를 분리한 후 잎만을 잘게 자른 후 정유 추출용 시료로 사용하였다.
컬럼은 DB-5MS 모세관 컬럼(길이 60 m, 내부직경 0.25 mm, 코팅필름 두께 0.25 μm; Agilent, CA, USA)을 사용하였다.
항 주름과 관련된 연구에 사용한 세포는 인간 피부 섬유 아세포(human dermal fibroblast, HDF) 세포로 CEFOBIO (Seoul, Korea) 에서 구입하였다. HDF는 DMEM 배지로 각각 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하였다.
데이터처리
모든 실험은 3 회 반복하여 측정하였고, 결과의 유의성을 검정하기 위해 분산분석(ANOVA)을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Bonferroni correction을 실시하였으며, 그 결과는 평균±표준편차로 표시하였다.
시료에 존재하는 물질들 중 표준물질이 확보되지 않은 물질들의 정성은 시료의 TIC 에서 S/N 비율 100 이상의 피크들의 질량스펙트럼을 NIST 11 (National Institute of Standards and Technology, MD, USA) mass spectral library와 비교하여 수행하였다. 이 때 NIST library-search 프로그램의 match 값이 가장 높은 것을 선택하여 monoterpene류와 sesquiterpene류를 중점적으로 확인하였고 피크들의 retention time (RT)와 비교 확인된 화합물명을 목록화하였다.
05 수준에서 Bonferroni correction을 실시하였으며, 그 결과는 평균±표준편차로 표시하였다. 이는 Prism (ver. 5.0, GraphPad Software, Inc., CA, USA)를 사용하여 분석하였다.
이론/모형
B16F10 mouse melanoma 세포주의 tyrosinase 활성은 Martinez-Esparza 외의 연구자들의 방법[18]을 사용하였다. 6-well plate에 well 당 세포를 3×105개 분주하고, 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
HDF에 적절한 자외선 유도를 확인하기 위해 조사 세기별 collagen type 1을 확인 한 결과 60 mJ/cm2 까지는 발현을 유지하는 것을 알 수 있었다(Fig. 5A).
이를 위하여 구상나무 추출물의 농도는 10-2-10-6 까지 10배수의 범위에서 처리하였다. 구상나무 추출물 10⁻5-10-6 의 농도에서는 두 세포주 모두 약 90% 이상 세포생존율을 보이며 통계적 유의성을 나타냈다. Fig.
구상나무 추출물의 콜라겐 생합성량 결과 양성대조군인 TGF-β 처리에 의한 생합성 보다는 낮지만 정상군 보다는 약 12% 개선된 PICP 생합성률을 보였다(Fig. 2B).
구상나무 추출물의 특징 및 피부 관련 추가 연구를 위해 구성요소 및 함량을 분석하였고(Table 1), Limonene, Camphene, alpha-Pinene, Bornyl acetate이 주요 구성물질임을 알 수 있었다. 특히 Limonene 의 경우 항암 연구가 많았으나 최근 항염증 및 항생제활성을 유도하여 피부 콜라겐 합성 증가와 염증세포 감소 등의 효과를 보인 연구가 보고되었다[19].
3C). 따라서, 구상나무 추출물이 B16F10 melanoma 세포 내 신호를 조절하여 멜라닌 생성 억제에 효과를 보이는 것으로 사료된다.
미백 효과를 측정하기 위해 tyrosinase 저해활성 억제 및 관련 세포신호 인자들의 발현을 확인하였고, 항주름 기능을 알아보기 위해 collagen 및 연관 단백질 분석을 실시하였다. 이러한 결과는 구상나무 추출물이 피부 개선 더 나아가 피부 노화억제에 효과적일 것으로 판단된다.
4 배의 저해효과 개선을 보였다. 이를 비교하였을 때 구상나무 추출물은 음성대조군 수준 이상인 약 2.8 배의 저해효과 억제를 보였고, 양성대조군과 비교하였을 경우에도 약 9.3배의 저해효과 억제를 보였다.
5B). 자외선 조사를 하지 않은 위의 연구에서는 10-5 농도에서 의미 있는 결과를 도출한 반면, 자외선 조건하에 서는 10배 희석된 10-6 농도에서 발현이 개선된 것을 알 수 있었다(정상군 대비 약 50% 회복). 이는 자외선에 영향을 받아 환경이 나빠진 HDF에 의한 것으로 유추된다.
본 실험에는 음성대조군 Arbutin 1 mg/ml과 양성대조군 α-MSH 250 nM을 사용하였으며 처리 후 48시간 이후 tyrosinase inhibition 측정을 실시하였다. 정상군을 100%로 기준하였을 때 음성대조군은 약 2.1 배의 저해효과 억제를 보였으며, 양성대조군은 약 2.4 배의 저해효과 개선을 보였다. 이를 비교하였을 때 구상나무 추출물은 음성대조군 수준 이상인 약 2.
자연적 노화 또는 자외선에 의한 외부 노화는 피부 세포 활성과 기능을 저하시키고 항상성과 재생을 조절하는 단백질 생합성을 저하시킴으로 유도된다[20, 24]. 첫째, 피부에 자외선을 받으면 색소침착이 유도되는데 이는 자외선 흡수에 의한 피부 세포의 손상을 억제할 목적으로 멜라닌(Melanin) 생성이 증가된 결과이다. 멜라닌은 피부와 머리카락의 색상을 조절하는 인자이며 과도한 멜라닌의 축적은 주근깨, 기미 등의 과색소 현상을 유발하고 피부노화를 촉진시킨다[14].
후속연구
36% 함유 되어 있으며 항산화 및 항생제활성을 나타냄이 보고되었다[25]. 따라서, 구상나무 추출물 또는 구별된 이의 추출물은 항산화에 의한 피부 노화 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
구상나무란 무엇인가?
소나무과 전나무속에 속하는 구상나무(Abies koreana E.H. Wilson)는 고산수종으로 약 500~1,500 m의 고지대에 자생한다. 구상나무는 희귀식물로서 세계자원보존연맹(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources, IUCN)의 희귀 및 멸종위기 식물의 분류범주에 약관심종 (Near threatened) 으로 등재되어 있으며, 주로 수목의 생육환경, 분포, 형태적 형질과 관련된 분류학적 연구, 재배 육종에 관한 연구가 주로 이루어져있다[18].
구상나무는 희귀식물로서 세계자원보존연맹에 무엇으로 등재되어 있는가?
Wilson)는 고산수종으로 약 500~1,500 m의 고지대에 자생한다. 구상나무는 희귀식물로서 세계자원보존연맹(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources, IUCN)의 희귀 및 멸종위기 식물의 분류범주에 약관심종 (Near threatened) 으로 등재되어 있으며, 주로 수목의 생육환경, 분포, 형태적 형질과 관련된 분류학적 연구, 재배 육종에 관한 연구가 주로 이루어져있다[18].
구상나무가 지닌 다양한 효능은 무엇인가?
구상나무에 대한 화학적 성분이나 생리활성에 대한 연구 자료는 많지 않으나, 구상나무 잎에 리그난 뿐만 아니라[10], α-pinene, camphene, limonene, bornyl acetate, borneol과 같은 여러 monoterpene류의 물질과 페놀성 화합물이 함유되어 있으며[20, 24], monoterpene으로 구성된 구상나무 잎 정유가 피부병원균이나 E. coli, MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 등의 다양한 미생물에 활성을 가지고 있다고 알려져 있다[5, 25]. 또한 구상나무 잎 추출물은 nitric oxide의 생성이나 암세포에 대한 억제효과나[19] 민간요법에서 소화불량, 혈관 및 폐질환에 효과가 있다고 보고되어 있다[24]. 이와 같이 다양한 효능이 밝혀지고 있지만 구상나무를 이용하여 피부와 연관된 미백 또는 주름 개선 연구 등은 알려진 바 없다.
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