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문제 정의
- 따라서, 본 실험에서는 분자량이 확연히 다른 3종의 키토산을 이용하여 식중독 유발세균 중 Gram negative 인 Escherichia coli O157 :H7과 Gram positive 인 Staphylocossus aureus, 그리고 candidiasis를 발병시키는 균으로 알려져 있는 진균류의 일종인 Candida albicans 에 대한항균 효과를 분석하여 키토산이 미생물의 세포벽에 미치는 영향을 검토하여 항균기작을 고찰하고자 하였다.
제안 방법
- E. coli O157 : H7, S. 와 C. albicans에 대하여 분자량 10,000인 키토산을 0.1 mg/mL 농도로 첨가하여 280nm에서 시간에 따라 홉 광도를 측정하였으며, 이를 bovine serum albumin을 표준단백질로 하여 단백질 농도를 계산하였으며 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 세 가지 처리구 모두 키토산에 대한 반응시간이 길어짐에 따라 세포 밖으로 유출된 단백질 함량이 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 모든 처리구에서 반응 1시간까지의 유출된 단백질량이 가장 많은 것으로 측정되었다.
- S. aureus의 damaged(leaked) cell number는 Tryptic soy agar(TSA) 및 NaCl이 7.5% 함유된 Tryptic soy agar(TSAS)에 동시에 분주하여 배양 후 형성되는 colony 수의 차이로 측정하였다.
- 0를 이용하여 colony수가 mL당 108 정도가 되게 희석하였다. 균수 희석액 10mL에 0.02mg/mL, 0.2mg/mL 및 2 mg/mL의 농도로 조정된 키토산 용액을 10mL 첨가한 후 30℃에서 orbital shaker(200 rpm)을 이용하여 진탕하였으며 일정 시간 마다 시료를 취하여 poured plate methodofl 의 하여 생존균수를 측정하였다. 키토산을 첨가하지 않은 대조구도 동시에 실험을 실시하여 측정된 데이터를 보정하였다.
- 본 실험에서 사용된 키토산 중 가장 항균 활성이 우수하다고 판단된 분자량 10,000인 키토산의 세포 손상 효과를 파악하기 위하여 0.1mg/mL의 농도로 처리한 후 세포벽(세포막)에 damage가 발생한 S. aureus의 생존균수를 측정하였다 (Fig. 6).그 결과, NaCl을 첨가하지 않은 배지(TSA에서 측정된 균수에 비하여 NaCl을 첨가하여 제조된 배지(TSAS)에서 측정된 균수가 대조구 대비 1/10 이하를 나타내었다.
- 분자량이 상이한 세 종류의 키토산의 항균 활성을 E.coli O157 : H7, S. aureus 및 C. albicans 균주를 이 용하여 측정, 분석하였다. E.
- 45 gm membrane filter를 이용하여 여과하였다. 여과한 액을 ICP-AES(Inductively coupled plasma atomic emission spectrophotometer, Jovin Yvon JY 138 Plus, France)로 분석하였다. 표준물질로는 ICP-AES용 Ca을 0.
- 키토산 분자량에 따른 E. coli O157 : H7, S. aureus, C. albicans에 대한 항균 특성을 고찰하기 위하여 키토산 올리고당 및 분자량이 10,000과 100,000인 두 종류의 키토산을 0.1 mg/mg 농도로 첨가하여 시간 경과에 따른 생존균수를 측정하였다 (Fig. 1). 처리구 중 분자량이 10,000인 키토산 처리구에서 4 log cycle의 균수가 감소하여 가장 높은 항균 활성을 나타내었으며, 키토산 올리고당은 2 log 정도의 균수 감소가 있는 것으로 측정되어 처리구 중 가장 낮은 항균 활성을 보였다.
- 키토산 첨가 농도에 따른 E. coli O157 :H7, S. aureus와 C. albicans에 대한 항균 활성을 파악하기 위하여 E. coli O157 :H7과 S. aureusS의 경우 가장 항균 활성이 높게 나타난 분자량 10,000인 키토산을, C. albicans의 경우에는 키토산 올리고당(분자량 1,000)을 0.01, 0.1 및 Img/mL의 수준으로 첨가하여 시간에 따른 미생물의 생존균수를 측정하였다(Fig. 2).
- 2mg/mL 및 2 mg/mL의 농도로 조정된 키토산 용액을 10mL 첨가한 후 30℃에서 orbital shaker(200 rpm)을 이용하여 진탕하였으며 일정 시간 마다 시료를 취하여 poured plate methodofl 의 하여 생존균수를 측정하였다. 키토산을 첨가하지 않은 대조구도 동시에 실험을 실시하여 측정된 데이터를 보정하였다.
- 항균력 측정 시 취한 시료를 원심분리(12,000×g, 20 분)하여 키토산 처리에 의해 사멸되었거나 세포막이 파괴된 미생물에서 유래한 단백질 및 핵산이 포함된 상등액을 얻었으며 단백질과 핵산의 농도는 각각 280 nm와 260nm에서 흡광도로 측정하였다. 단백질 농도의 경우 bovine serum albumin을 표준단백질로 하여 환산하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 키토산 올리고당은 키토산 6량체(chitohexaose hydrochloride)를 일본의 Wako chemical에서 구입하여 사용하였으며 그 이외의 키토산은 Hackman 방법(14), 을 부분 수정하여 제조하였다. 즉, 홍게 다리부의 껍질을 분쇄한 후 이를 3% 염산으로 처리하여 키틴을 얻었고 이를 50% NaOH로 처리, 탈 아세틸화하여 키토산을 얻었다.
- 키토산 올리고당은 glucosamine 6량체를구입하여 사용하였으며, 분자량 10,000, 100,000인 키토산은 실험실에서 제조하여 사용하였다.
- 여과한 액을 ICP-AES(Inductively coupled plasma atomic emission spectrophotometer, Jovin Yvon JY 138 Plus, France)로 분석하였다. 표준물질로는 ICP-AES용 Ca을 0.1, 1, 10 ppm으로 조제하여 3점을 이용한 검량 곡선을 작성하였으며 393.366 nm 에서 측정하였다.
- 항균 활성을 측정하기 위한 균주로는 E. coli O157: H7(ATCC 43894), S. aureus(ATCC 144458)와 C.albicans(KFW. 432)를 대상균 주로 하였으며 균체의 생육 배지로는 Nutrient broth, Tryptic soy broth와 YMbroth를 각각 사용하였다.
성능/효과
- E. coli O157 : H7 및 S. aureus에 대한 항균력은 첨가된 키토산 농도가 0.1 mg/mL일 경우 가장 높은 항균 활성을 나타내었으며 키토산 농도 1 mg/mL로 10배중가시켰을 경우에는 오히려 감소하는 특성을 나타내었다. Sudarshan 등(15), 은첨가되는 키토산에 의해 균주의 응집이 많이 발생할수록 항균력이 크게 나타난다고 하였는데 1 mg/mL 키토산 처리구의 경우 미생물세포벽과 결합한 키토산 농도가 증가함으로 인해 미생물 사이의 반발력이 발생하여 균주의 응집 현상이 방해 되었기 때문으로 생각되었다.
- albicans 균주를 이 용하여 측정, 분석하였다. E. coli O157 :H7와 S. aureus 에 대해서는 분자량 10, 000인 키토산이 가장 강한 항균 활성을 보였으며 C. dAcwu에 대해서는 6량체의 키토산 올리고당이 가장 강한 활성을 나타내었다. 키토산 첨가 농도는 E.
- S. aureusS의 경우도 E. coli O157 : H7와 거의 유사한 경향을 나타내어 분자량이 10,000인 키토산이 가장 높은 항균 활성을 나타내는 것으로 측정되었다. 그러나 S.
- S. aureus에 대한 세포막 손상 정도를 측정하여 본 결과 전체 미생물균체중 약 10%에 상당하는 균수가막손상을 가져왔다. 따라서, 키토산은 고유의 양이온성 성질을 이용하여 미생물의 세포벽과 세포막에 결합하여 그 결과로 세포 내 물질의 세포 외로의 유출 내지는 세포막 대사의 저해 등의 효과를 나타냄으로써 항균 활성을 나타내는 것으로 추측되었다.
- 6).그 결과, NaCl을 첨가하지 않은 배지(TSA에서 측정된 균수에 비하여 NaCl을 첨가하여 제조된 배지(TSAS)에서 측정된 균수가 대조구 대비 1/10 이하를 나타내었다. 이로서, 키토산이 세포막의 damage를 유발시켜 세포 내부물질의 efflux가 발생했음을 시사하고 있으며 또한 단백질과 핵산의 유출량이 반응 1시간 이내에 최대로 측정된 Fig.
- coli O157 : H7와 거의 유사한 경향을 나타내어 분자량이 10,000인 키토산이 가장 높은 항균 활성을 나타내는 것으로 측정되었다. 그러나 S. aureus에 대한 키토산의 항균 활성은 E. coli O157 : H7에 비하여 전반적으로 낮게 나타났으며 가장 항균 활성이 우수하다고 판단된 분자량 10,000인 키토산의 경우 2 log 정도로 균수가 감소하는 것으로 나타났다.
- 또한 항균 활성이 60분 이내에 높게 나타난 것은 키토산이 항균 작용을 일으킨 물질에 계속적으로결합되어 있음을 시사해준다. 따라서 키토산의 항균효과는 생화학적 기작이라기 보다는 분자고유의 cationic한 특성에 의한 흡착, 결합 등 물리적인 방법에 의하여 세포벽에 결합, damage를 유발하여 세포 내 물질의 유출, 세포막 대사 저해 등의 기작으로 항균 활성을 나타내는 것으로 사료되었다.
- aureus에 대한 세포막 손상 정도를 측정하여 본 결과 전체 미생물균체중 약 10%에 상당하는 균수가막손상을 가져왔다. 따라서, 키토산은 고유의 양이온성 성질을 이용하여 미생물의 세포벽과 세포막에 결합하여 그 결과로 세포 내 물질의 세포 외로의 유출 내지는 세포막 대사의 저해 등의 효과를 나타냄으로써 항균 활성을 나타내는 것으로 추측되었다.
- albicaas의 경우는 chitohexaose 1 mg/mL의 농도에서 항균 활성이 가장 높았다. 모든 키토산 처리구에서 미생물 사멸 속도는 키토산 처리 1시간 이내에서 가장 높게 나타났으며 그 이후로는 점차 낮은 속도를 보였다. 사멸되었거나 파손된 미생물 세포로부터 유래되는 단백질, 핵산물질 및 Ca2+의 량은 키토산 처리 1시간 이내에 가장 많았으며 β-galactosidase 활성도 같은 시간대에서 가장 빠른 속도로 중대되는 것으로 나타났다.
- 반면, C. albicans의 경우는 키토산 농도가 증가할수록 항균 활성이 우수한 것으로 나타났으며 키토산 올리고당의 경우 균수 감소 1 log 수준의 미약한 항균 활성을 나타내었다. 키토산 처리 후 60분을 기준으로 균사멸 속도를 측정하여 Table 2에 나타내었다.
- albicans에 대한 키토산의 항균력은 위에 기술한 두 종의 균에 비하여 다소 다른 양상을 나타내었다. 분자량이 10,000인 키토산보다 분자량이 약 10배 작은 키토산 올리고당이 가장 강한 활성을 나타내었다. 이는 C.
- 모든 키토산 처리구에서 미생물 사멸 속도는 키토산 처리 1시간 이내에서 가장 높게 나타났으며 그 이후로는 점차 낮은 속도를 보였다. 사멸되었거나 파손된 미생물 세포로부터 유래되는 단백질, 핵산물질 및 Ca2+의 량은 키토산 처리 1시간 이내에 가장 많았으며 β-galactosidase 활성도 같은 시간대에서 가장 빠른 속도로 중대되는 것으로 나타났다.
- 3에 나타내었다. 세 가지 처리구 모두 키토산에 대한 반응시간이 길어짐에 따라 세포 밖으로 유출된 단백질 함량이 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 모든 처리구에서 반응 1시간까지의 유출된 단백질량이 가장 많은 것으로 측정되었다.
- 그 결과, NaCl을 첨가하지 않은 배지(TSA에서 측정된 균수에 비하여 NaCl을 첨가하여 제조된 배지(TSAS)에서 측정된 균수가 대조구 대비 1/10 이하를 나타내었다. 이로서, 키토산이 세포막의 damage를 유발시켜 세포 내부물질의 efflux가 발생했음을 시사하고 있으며 또한 단백질과 핵산의 유출량이 반응 1시간 이내에 최대로 측정된 Fig. 3과 Fig. 4 결과와 함께 고찰해볼 때 키토산의 항균력은 미생물의 세포막 손상에 의한 것으로 생각되었다.
- albicans에서도 유사하였다. 이상의 결과는 키토산의 항균 활성 발현이 양이온성 성질에 기인하기 때문에 키토산 첨가 초기에결합된 키토산이 세포 사멸 후에도 계속적으로 세포벽에 결합되어 있어 항균 활성 반응에 참여할 수 있는 키토산 분자 수가 감소하기 때문으로 추정되었다.
- 1). 처리구 중 분자량이 10,000인 키토산 처리구에서 4 log cycle의 균수가 감소하여 가장 높은 항균 활성을 나타내었으며, 키토산 올리고당은 2 log 정도의 균수 감소가 있는 것으로 측정되어 처리구 중 가장 낮은 항균 활성을 보였다.
- 7에 나타내었다. 키토산 처리 직후의 칼슘은 25.08 ng/mLS- 측정되었으며 시간이 경과함에 따라 급속히 증가하는 경향이었고 분자량 10,000 인 키토산을 처리한 처리구의 칼슘 농도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 세포벽에 주요 구성성분인 teichoic acid와 키토산이 결합함으로서 Ca2+의해리를 유발한다는 황 등(17)의 결과와 유사한 경향이었다.
- 있기 때문으로 생각되었다. 키토산 처리 후 세포로부터 단백질, 핵산 관련 물질 및 Ca2+이 유출되었으며 또한 NaCl이 첨가된 배지에서 생존하지 못하는 균주가 존재한다는 사실은 키토산의 항균 작용은 미생물의 세포벽 및 세포막의 rigidity와 stability를 낮취서결과적으로 bacteriocidal한 효과가 나타나는 것으로 생각되었다. 또한 항균 활성이 60분 이내에 높게 나타난 것은 키토산이 항균 작용을 일으킨 물질에 계속적으로결합되어 있음을 시사해준다.
- dAcwu에 대해서는 6량체의 키토산 올리고당이 가장 강한 활성을 나타내었다. 키토산 첨가 농도는 E. coli O157 :H7와 S.aureus의 경우 0.1 mg/mL의 농도에서, C. albicaas의 경우는 chitohexaose 1 mg/mL의 농도에서 항균 활성이 가장 높았다. 모든 키토산 처리구에서 미생물 사멸 속도는 키토산 처리 1시간 이내에서 가장 높게 나타났으며 그 이후로는 점차 낮은 속도를 보였다.
- 한편, lactose 배지를 이용하여 g-galactose 를 induction 시킨 E. coli O157 :H7에 대하여 분자량이 다른 키토산을 0.1 mg/mL의 농도로 첨가한 후 30분, 60분 경과 후의 P-galactosidase 함량을 측정한 결과, 분자량 10,000인 키토산을 처리하였을 경우 가장 높은 galactosidase 활성을 나타내고 있어 키토산 처리에 의한 항균 활성의 크기나 강도는 단백질의 유출량과 깊은 관련이 있음을 확인할 수 있었다 (Fig. 5).
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