선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 논문에서는 한국 재래식 메주로부터 protease 활성이 매우 높은 것으로 평가된 Bacillus subtilis PCA 20-3을 선발하여 재래식 된장과 간장의 맛 성분의 생산에 효소가 어떻게 관여하는지와 그 효소들 중 한국 재래식 메주의 독특한 맛 성분 생산에 크게 관여하는 효소를 밝혀 앞으로의 균 육종에 이용할 뿐만 아니라, 기능성 peptide의 생산을 위한 미생물유래 protease 의 생산기반을 구축하기 위한 전단계 연구로서 Bacillus subtilis PCA 20-3 유래의 protease의 생산과 특성에 관해 연구하여 균주 육종 및 단백질 분해효소에 대한 기초자료로 활용하고자 한다.
- 한국 전통 메주로부터 분리•동정한 Bacillus subtilis PCA20-3이 생산하는 protease의 생산조건과 특성을 조사하였다. Protease의 생산 최적조건은 0.
- 이러한 관점에서 본 연구는 콩 펩타이드의 연구에 있어 콩 단백질을 분해하는 protease의 이용을 위한 기초자료로서 응용될 수 있으리라 기대된다. 현재 본 연구팀은 B. subtilis PCA203 이 분비하는 protease를 정제하고 N- terminal amino acid sequence를 조사하고 있다. 앞으로 정제 효소의 primary structure와 같은 분자레벨의 연구가 이루어져야 할 것이며, 또한 효소의 각 아미노산에 대한 기질 특이성 등이 연구된다면 콩 펩타이드 제조공정에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
제안 방법
- pH의 영향은 0.2 M Britton-Robinson buffer pH 2.0-12.0까지의 범위에서 효소와 기질을 혼합하여 37℃, 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였으며, pH 안정성은 효소액을 pH 2.0-12.0 범위에서 각 pH 별로 30 "C에서 1시간 정치한 후 pH 8.0으로 환원시킨 다음, 37℃에서 30분간 효소액과 기질을 반응시켜 잔존 효소 활성을 측정하였다. 온도의 영향은 pH 8.
- 금속이온에 대한 영향은 각종 금속염을 2×10-3M 되게 pH 8.0의 중류수에 녹이고 금속이온 용액 0.5 mL와 효소액 0.5 mL를 섞어 30℃에서 60분간 정치한 다음 잔존 효소활성을 측정하였으며 저해제의 영향은 0.5 mL의 각종 저해제와 0.5 mL의 효소액을 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 잔존활성을 측정하였다.
- 0으로 환원시킨 다음, 37℃에서 30분간 효소액과 기질을 반응시켜 잔존 효소 활성을 측정하였다. 온도의 영향은 pH 8.0의 0.1 M Tris-HClbuffer와 효소, 기질을 혼합한 후, 20, 30, 40, 50, 60, 70℃의 각 온도에서 반응시켜 효소활성을 측정하였으며, 온도에 대한 안정성은 각 온도에서 효소를 1시간 정치시킨 다음, 기질과 혼합 후, 37℃에서 30 분간 반응시켜 잔존 효소활성을 측정하였다.
- 0으로 조정한 후, 30℃에서 20시간 균주를 배양하여 효소 활성을 측정함으로서 최대활성이 검출된 pH를 효소생산 최적 pH로 설정하였다. 최적온도는 효소생산 최적 pH인 7.0에서 온도의 범위를 25-45℃로 달리하여 20시간 균주를 배양하여 상기와 동일한 방법으로 설정하였고, 배양시간은 최적 pH와 온도인 pH 7.0과 30℃에서 0-30시간 배양하여 최대활성이 검출된 것을 최적배양시 간으로 설정하였다.
- 온도를 조사하였다. 탄소원은 기본배지(0.2% NH4NO3, 0.1% K/HPQ, , 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSQ, . 7H2O, 0.01% yeast extract)에 각 탄소원을 2%되게 조정하여 30℃에서 20시간 배양한 후 protease 활성 을 측정 하였으며 , 유기 질소원은 0.2%, 무기 질소원은 0.1%, 무기염류는 0.2%되도록 조정하여 측정하였다. 효소생산에 미치는 초기 pH의 설정은 효소생산 최적배지[0.
- 효소 생산에 미치는 배지의 조성을 조사하기 위하여 탄소원, 유기질소원, 무기질소원, 무기염류, 초기 pH, 온도를 조사하였다. 탄소원은 기본배지(0.
- 2%되도록 조정하여 측정하였다. 효소생산에 미치는 초기 pH의 설정은 효소생산 최적배지[0.2% soytone, 2% soluble starch, 0.1% (NH4)2SO4, 0.2% CaCl2, 0.01% yeast extract, 0.1% K2HPO4 0.1% KH2PO4]를 이용하여 초기 pH를 5.0- 9.0으로 조정한 후, 30℃에서 20시간 균주를 배양하여 효소 활성을 측정함으로서 최대활성이 검출된 pH를 효소생산 최적 pH로 설정하였다. 최적온도는 효소생산 최적 pH인 7.
- 효소의 특성을 조사하기 위해서 최적배지와 최적배양조건에서 배양하고 원심분리한 상등액을 조효소액으로 제조하였다. Casein을 기질로 하였을 때, 본 효소의 효소역가는 151 unit이었다.
- 효소활성에 영향을 미치는 화학적 저해제 중, metal protease 저해제인 EDTA, 말단아미노산 잔기가 활성 부위인 효소의 저해제인 2,4-DNP, 활성부위에 SH기를 가진 thiol protease 저해제인 PCMB, serine protease의 저해제인 PMSF을 선정하여 Bacillus subtilis PCA 20- 3의 protease 활성에 미치는 영향을 검토하였다. Table 3에서 보는 바와 같이 활성 serine 잔기에 특이적으로 결합하여 효소작용을 저해하는 PMSF에 의해 protease 활성이 89.
대상 데이터
- 균주는 유 등(16)이 재래식 메주에서 protease 활성이 높은 균주로 선발한 Bacillus subtilis PCA 20-3를 사용하였으며, hammarstein casein(H. casein)은 Merck 제품을, penymethanesulfonyl fluoride(PMSF), p-Chloro- mercuribenzoic acid(PCMB), ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), 2, 4-dinitrophenol(2, 4-DNP), bovine serum albumin(BSA)은 Sigma 제품을, 그 밖의 시약은 일급시약을 사용하였다.
이론/모형
- 효소 활성은 Hagihara의 방법(17)에 준하여 측정하였다. 즉, 조효소액 0.
성능/효과
- 4와 같다. 효소액 0.5 mL과 0.1 M Tris-HCl buffer 1 mL, 기질 2.5 mL를 혼합하여 각 온도에서 반응시킨 후 효소활성을 측정한 결과, 55℃에서 반응하였을 때 최대활성이 검출되어본 효소의 최적 은도는 55℃이었으며, 효소액과 완충용액을 흔합한 후 각 온도에서 1시간 방치한 다음, 기질과 혼합하여 37"C에서 30분간 반응시켜 효소 활성을 측정한 결과, 20~45℃ 범위의 온도에서 안정한 것으로 나타났으며 50"C 이상에서 급격히 효소활성이 감소하였다. 본 효소의 열에 대한 영향은 안 등(26) 이 등(28) Tsuru 등(23), 오 등(29)의 Bacillus sp의 최적온도가 55℃ 이었다고 한 보고와 황(18)의 40℃ 이상의 높은 온도에서 최대활성을 검출되었다는 보고와 일치하였다.
- B. subtilis PCA 20-3의 protease 생산은 배양시간과 온도에 대해 매우 민감한 것으로 나타났다. 이 결과는이 등"*의 Bacillus속 유래의 alkaline protease가 pH 7.
- Table 3에서 보는 바와 같이 활성 serine 잔기에 특이적으로 결합하여 효소작용을 저해하는 PMSF에 의해 protease 활성이 89.2%까지 현저히 저해되었고, thiol proteasef- 저해하는 PCMB에 의해 5L8%의 활성이 저해되는 것으로 나타나, 본 효소는 효소 활성부위에 serine 잔기를 가지는 serine protease인 것으로 시사되었으며, 촉매부위에 cystein 잔기가 존재할 가능성도 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 간장 유래의 B.
- Casein을 기질로 하였을 때, 본 효소의 효소역가는 151 unit이었다. pH 2.0-12.0 범위의 완충용액 1 mL에 기질 2.5 mL를 혼합한 다음, 효소 0.5 mL를 가하여 3TC에서 30분간 반응시켜 효소활성을 측정한 결과(Fig. 3), 최적 pH는 6.0~11.0의 범위이었다. 효소의 pH 안정성은 효소와 완충용액을 혼합한 후 3(TC에서 1시간 방치 후, 기질을 혼합한 다음, 37>C에서 30분간 반웅시켜 효소의 pH 안정성을 조사한 결과 (Fig.
- 먼저 2%의 탄소원을 첨가하여 배양한 결과, sucrose 첨가 시의 활성을 100%로 하였을 경우, soluble starch 첨가 시 229%, fructose 첨가 시 176%로 효소활성이증가되었으며, maltose 첨가 시는 오히려 활성이 현저히 저하되어 8%의 활성이 검출되어 탄소원은 효소생성에 크게 영향을 미치지는 것으로 나타났다. 기본 배지에 유기질소원을 각각 0.2%씩 첨가하여 30℃에서 20시간 배양한 결과는 soytone이 존재하는 배지에서 효소 활성이 129% 검출되어 유기질소원 중 효소생산에 가장 효과적이었다. 무기질소원을 0.
- 효소생산량은 배양 16시간 이후부터 급격히 중가하여 배양 20시간에서 최대활성이 검출되었으나 20시간 이후 급격히 저하되었다. 따라서 최대 활성이 검출된(효소 최대 생산)시점은 exponential phase의 말기 시점 으로서 균체 량과 효소생 산량과의 상관관계 는 약간의 차이가 있는 것으로 나타났다. 한편, stationary phase 이후 효소활성이 급격히 저하된 이유는 아직 밝혀지지 않았다.
- 먼저 2%의 탄소원을 첨가하여 배양한 결과, sucrose 첨가 시의 활성을 100%로 하였을 경우, soluble starch 첨가 시 229%, fructose 첨가 시 176%로 효소활성이증가되었으며, maltose 첨가 시는 오히려 활성이 현저히 저하되어 8%의 활성이 검출되어 탄소원은 효소생성에 크게 영향을 미치지는 것으로 나타났다. 기본 배지에 유기질소원을 각각 0.
- 2%씩 첨가하여 30℃에서 20시간 배양한 결과는 soytone이 존재하는 배지에서 효소 활성이 129% 검출되어 유기질소원 중 효소생산에 가장 효과적이었다. 무기질소원을 0.1% 농도로 첨가한 결과, (NH4)2SO4 첨가 시 120%의 효소생산량이 중가한 반면, NH4NO3에 의해서는 NaNO3 첨가 시에 비해 활성이 1% 검출되어 효소생성량이 가장 낮았다. 한편, 0.
- 2와 같이 Fe?와 Cu*에 의해서만 각각 28%, 55%로 효소활성이 감소되었으며 그 밖의 다른 금속이온은 효소활성에 크게 영향을 미치지 않았다. 이와 같은 결과는 최 등(20)의 Bacillus sp.
- 이상과 같은 결과로부터 B. subtilis PCA20-3이 생산하는 protease는 alkaline protease의 특성을 가지고 있으면서 pH 5.0이상에서도 80% 이상의 활성을 유지하고 있고 된장과 간장의 발효기간을 0~70일간으로 설정하였을 경우, pH의 변화범위가 각각 pH 5.3~7.7, 5.4 ~8.0인 것으로 보고된 바 있어(32) 된장과 간장의 숙성기간 중에도 단백질 분해활성이 높게 유지될 것으로 판단된다. 그리고 효소반응속도상수에서 초기 최대 반응속도 Vmax가 100㎍/min으로서 메주나 간장유래의 다른 세균에 비해 비교적 높게 나타나, 된장과 간장의 제조원료가 되는 메주의 대량생산 공정에 B.
- 1과 같다. 즉, pH의 영향은 효소활성에 큰 영향을 미치지 않았으나 pH 7.0에 최대활성이 검출되었으며, 온도의 영향은 배양온도에 따라 큰 차이가 있었는데 30℃ 배양 시 최대활성이 검출되었으나 그 이상에서는 활성이 급격히 감소하였다. 배양시간별 효소활성은 20시간 배양 시 최대를 나타내었으나 그 후 급격히 감소하여
- 최적배지 및 배양조건에서의 균체생육과 효소생산과의 상관관계를 조사한 결과(Fig. 2), 균의 exponential phase는 12~20시간이었으며, stationary phase는 22-26시간이었다. 효소생산량은 배양 16시간 이후부터 급격히 중가하여 배양 20시간에서 최대활성이 검출되었으나 20시간 이후 급격히 저하되었다.
- 1% 농도로 첨가한 결과, (NH4)2SO4 첨가 시 120%의 효소생산량이 중가한 반면, NH4NO3에 의해서는 NaNO3 첨가 시에 비해 활성이 1% 검출되어 효소생성량이 가장 낮았다. 한편, 0.2%의 무기염류를 배지에 첨가한 결과, CaCl2 첨가 시 효소활성이 354%에 이르는 높은 중가를 보인 반면 FeSQ, 첨가 시에는 효소생산량이 17%로 감소하였다.
- 2), 균의 exponential phase는 12~20시간이었으며, stationary phase는 22-26시간이었다. 효소생산량은 배양 16시간 이후부터 급격히 중가하여 배양 20시간에서 최대활성이 검출되었으나 20시간 이후 급격히 저하되었다. 따라서 최대 활성이 검출된(효소 최대 생산)시점은 exponential phase의 말기 시점 으로서 균체 량과 효소생 산량과의 상관관계 는 약간의 차이가 있는 것으로 나타났다.
- 0의 범위이었다. 효소의 pH 안정성은 효소와 완충용액을 혼합한 후 3(TC에서 1시간 방치 후, 기질을 혼합한 다음, 37>C에서 30분간 반웅시켜 효소의 pH 안정성을 조사한 결과 (Fig. 3), pH 6.0~110의 범위에서 효소가 안정한 것으로 나타났다. 이 결과는 Tsuru 등(23) 문(24), 김 등(25), 황(19)이 보고한 Bacillus sp의 alkaline protease의 최적 pH가 10.
후속연구
- 0인 것으로 보고된 바 있어(32) 된장과 간장의 숙성기간 중에도 단백질 분해활성이 높게 유지될 것으로 판단된다. 그리고 효소반응속도상수에서 초기 최대 반응속도 Vmax가 100㎍/min으로서 메주나 간장유래의 다른 세균에 비해 비교적 높게 나타나, 된장과 간장의 제조원료가 되는 메주의 대량생산 공정에 B. subtilis PCA20-3의 사용이 긍정적으로 평가될 수 있을 것으로 사료된다. 최근 한국 전통 발효식품에 대한 우수성을 찾고자 하는 연구가 왕성하게 진행되고 있으며, 그 중 콩을 원료로 한 발효식품에 있어 콩 펩타이드의 생리 기능성의 검중에 대한 연구 또한 체계적으로 이루어지고 있다.
- subtilis PCA203 이 분비하는 protease를 정제하고 N- terminal amino acid sequence를 조사하고 있다. 앞으로 정제 효소의 primary structure와 같은 분자레벨의 연구가 이루어져야 할 것이며, 또한 효소의 각 아미노산에 대한 기질 특이성 등이 연구된다면 콩 펩타이드 제조공정에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이와 같은 펩타이드 연구를 위해서는 먼저 한국 전통 콩 발효식품으로부터 다양한 단백질 분해효소에 대한 연구가 이루어져야 한다. 이러한 관점에서 본 연구는 콩 펩타이드의 연구에 있어 콩 단백질을 분해하는 protease의 이용을 위한 기초자료로서 응용될 수 있으리라 기대된다. 현재 본 연구팀은 B.
- 최근 한국 전통 발효식품에 대한 우수성을 찾고자 하는 연구가 왕성하게 진행되고 있으며, 그 중 콩을 원료로 한 발효식품에 있어 콩 펩타이드의 생리 기능성의 검중에 대한 연구 또한 체계적으로 이루어지고 있다. 이와 같은 펩타이드 연구를 위해서는 먼저 한국 전통 콩 발효식품으로부터 다양한 단백질 분해효소에 대한 연구가 이루어져야 한다. 이러한 관점에서 본 연구는 콩 펩타이드의 연구에 있어 콩 단백질을 분해하는 protease의 이용을 위한 기초자료로서 응용될 수 있으리라 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.