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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 대두단백질의 가수분해물의 기능특성의 개선과 식품으로의 이용성을 증가시키기 위하여, 기존의 단백질 분해효소와는 다른 우리 나라의 전통 메주에서 분리한 균주가 생산하는 protease에 의해 분해되는 대두단백질 가수분해물의 특성과 이용성 연구의 일환으로, 우리 나라 전통 메주에서 분리한 Aspergillus wentti가 생산하는 protease를 분리・정제하고 그 특성을 조사하였기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0-12.E지의 범위에서 각 pH별로 30。(2에서 1시간 정치한 후 pH 8.0으로 환원시킨 다음, 37℃에서 30분간 효소액과 기질을 반응시켜 잔존 효소활성을 측정하였다. 온도의 영향은 pH 8.
- 하였다. 36.2 mL/hr의 유속으로 7 mL씩 분획한 결과, Fig. 3에서와 같이 20~32번 튜브에서 효소활성이 검출되었으며, 24~30번을 활성단백질로서 분획하였다. 이때의 비활성도는 213 unit/mg, 수율은 80.
- Asp. wentti가 생산하는 protease 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 Table 3과 같이 본 protease는 PMSP에 의해 특이적으로 저해되어 활성이 86% 실활되는 것으로 나타나 본 효소는 촉매부위에 활성 serine을 가진 serine protease인 것으로 시사되었다.
- 금속이온에 대한 영향은 각종 금속염을 2 X 10-3 M되게 pH 6.0의 증류수에 녹이고 금속이온 용액 0.5 mL와 효소액 0.5mL를 섞어 30℃에서 60분간 정치한 다음 잔존 효소활성을 측정하였으며 저해제의 영향은 0.5mL의 각 종 저해제(0.2 mM과 2 mM)와 0.5 mL의 효소액을 30℃에서 30분간 반응시킨 다음 잔존활성을 측정하였다.
- 단백질 가수분해 효소의 분리 정도와 분자량을 구하기 위하여 Laemmli의 방법에 준하여 Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 수행하였고, Coomassie brilliant blue R-250(Coomassie brilliant blue R-250 2.5 g/lL의 methanol : acetic acid : water = 5 : 1 : 5의 용액)을 사용하여 단백질 밴드를 염색하고, 탈색은 용액 I (methanol : acetic acid : water = 5 : 1 : 5)으로 15분간 세척 후, 계속해서 용액 II(methanol : acetic acid : water = 2 : 1 : 7)로 30분, 용액 III(10% acetic acid으로 하루 밤 탈색하였다. 이때 stacking gel과 separating gel의 농도는 각각 4.
- 먼저, 원심분리한 조효소액 전량을 20 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)로 평준화시킨 QAE 및 SP Sephadex 이온교환 수지 columm(2.6 X 55 cm)에 통과시켜 비흡착성 활성단백질을 분획한 다음, 이를 동결건조한 후, 상기 buffer로 평준화시킨 Sephadex G-100 column(2.6 X 55 cm)을 이용하여 2차례에 걸쳐 gel filtration하여 protease 활성이 검출된 부분을 분획하여 Aspergillus wentti가 생산하는 protease를 정제하였다.
- 분획물을 동결건조한 후, protease를 순수분리하기 위해서 Sephadex G-100 칼럼에 전량을 재충진시켜 rechromatography하였다. 36.
- 0으로 환원시킨 다음, 37℃에서 30분간 효소액과 기질을 반응시켜 잔존 효소활성을 측정하였다. 온도의 영향은 pH 8.0의 0.1M Tris-HCl buffer와 효소, 기질을 혼합한 후, 20, 30, 40, 50, 60, 70℃의 각 온도에서 반응시켜 효소활성을 측정하였으며, 온도의 안정성은 각 온도에서 효소를 1시간 정치시킨 다음, 기질과 혼합 후, 37℃에서 30분간 반응시켜 잔존 효소활성을 측정하였다.
- Table 1과 같다. 즉, Aspergillus wentti를 배양한 밀기울 배지로부터 조효소를 추출하고, 조효소액 전량을 20 mM Tris-HCl buffer로 평준화시킨 QAE Sephadex에 충진시켜 비흡착 활성단백질을 분획한 다음, 이를 다시 SP Sephadex 이온교환수지에 충진시켜 비흡착 활성단백질을 분획하였다. 그 결과, 비활성도는 96.
- 한국의 재래식 메주로부터 분리, 동정한 Aspergillus wentti가 생산하는 protease를 정제하고 그 특성을 조사하였다. 기본배지[밀기울 : 1% glucose 함유 H2O = 1 : 1(w/v)]에서의 효소생산 최적조건은 pH 9.
- 효소의 정제는 open column이 장착된 ISCO사(미국)의 ProTeam LCTM을 이용하여 정제하였다. 먼저, 원심분리한 조효소액 전량을 20 mM Tris-HCl buffer(pH 8.
- 0, 30℃, 4일이었다. 효소의 정제는 먼저 배양 밀기울로부터 20 mM phosphate(pH 8.0)로 효소를 추출하고 QAE-Sephadex와 SP-Sephadex의 ion exchange chromatography로 비 흡착성 활성단백질을 분리한 후 두차례의 Sephadex G-100 gel filtration로서 분자량 약 32,000(SDS-PAGE분석 : 단일밴드)의 비활성도 213 unit/mg, 정제배수 27.3배로 효소를 정제하였다. 본 효소의 Km값은 3.
대상 데이터
- 5%, 12%이었다. 분자량 marker는 Sigma사로부터 구입한 prestainning marker로서 phosphorylase B(M.W. : 102,000), bovine serum albumin(M.W. : 81,000), ovalbumin(M.W. : 46,900), carbonic anhydrase(M.W. :32,700), soybean trypsin inhibitor(M.W. : 30,200), egg lysozyme(M.W.: 24,000)이 혼합된 것을 사용하였다
- 재래식 메주 유래의 균주로 유 등(8)이 분리한 Aspergillus wentti을 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 단백질의 정량은 Lowiy 방법(10)에 따라 측정하여 bovine serum albumin을 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 단백질 함량을 계산하였으며, 효소 정제과정 중의 단백질의 농도는 spectrophotometer를 사용하여 280 nm에서 흡광도로 측정하였다.
- 효소활성측정은 Hagihara의 방법(9)에 준하여 측정하였다. 즉, 효소액 0.
성능/효과
- Effect of temperature(A), initial pH(B) and incubation time(C) on the production of protease from Aspergillus wentii. (A) Enzymatic activities at different temperatures were measured at pH 8.0 for 4 days incubation, (B) Enzymatic activities at different pH were measured at 30°C for 4 days incubation, (C) Enzymatic activities at different time intervals were measured at pH 8.0 and 30°C.
- Aspergillus wentti의 protease 생산을 위한 최적 배양온도 및 pH, 배양시간을 조사한 결과 Fig. 1에서와 같이 30℃와 pH 8~9에서 배양시 최대의 생산을 보였고 배양시간별 효소활성은 3~5일간 배양시 최대를 나타났다. 배양시간별 활성은 차 등(12)과 이와 정(13)의 Asp.
- 93 µg/min), Syn. racemosum (Km 값, 0.6 x 10-1 M; Vmax 값, 2.14µg/ min), B. subtilis (Km, 5 X 10-4 M; Vmax, 100 µg/min)의 H. casein을 이용한 protease의 kinetic parameter 비교해 볼 때 효소반응속도가 높은 것으로 나타났다.
- wentti가 생산하는 protease 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 Table 3과 같이 본 protease는 PMSP에 의해 특이적으로 저해되어 활성이 86% 실활되는 것으로 나타나 본 효소는 촉매부위에 활성 serine을 가진 serine protease인 것으로 시사되었다.
- 즉, Aspergillus wentti를 배양한 밀기울 배지로부터 조효소를 추출하고, 조효소액 전량을 20 mM Tris-HCl buffer로 평준화시킨 QAE Sephadex에 충진시켜 비흡착 활성단백질을 분획한 다음, 이를 다시 SP Sephadex 이온교환수지에 충진시켜 비흡착 활성단백질을 분획하였다. 그 결과, 비활성도는 96.1 unit/mg protein, 수율은 87.6%, 정제도는 12.3배였다.
- 기질농도와 효소활성과의 관계를 검토하기 위하여 Hammarstein casein을 0.25 X 10-1~4.0 X 10-4 M로 기질농도를 달리하였을 때 효소활성의 변화를 측정한 후 Lineweaver-Burk plotting한 결과, Fig. 4와 같이 Km 값이 3.049 X 10-1M, Vmax 값은 151.1 µg/min이었다. 이와 같은 결과는 차와 최(12)의 Asp.
- 본 호소의 기질특이성은 0.6%의 H. casein과 bovine serum albumin(BSA)을 제조하여 시간별 효소활성을 측정하여 조사한 결과, Fig. 5에서와 같이 BSA 보다 H. casein을 기질로써 더 잘 가수분해하였다. 이는 차와 최가 Asp.
- 3배로 효소를 정제하였다. 본 효소의 Km값은 3.049 X 10-4 M, V 값은 151.1 µg/min이었으며 ISP, hemoglobin, bovine albumin보다 casein에 대해 가수분해력이 높은 것으로 나타났다. 정제효소의 최적작용 pH와 온도는 pH 9.
- 본 효소의 pH에 대한 영향을 조사한 결과, Fig. 5에서와 같이 최적 pH가 7.0~11.0으로서 본 효소는 alkaline protease인 것으로 나타났다. 이와 정(13)은 Asp.
- 1 µg/min이었으며 ISP, hemoglobin, bovine albumin보다 casein에 대해 가수분해력이 높은 것으로 나타났다. 정제효소의 최적작용 pH와 온도는 pH 9.0, 50℃였으며 pH 4.0~11.02] 범위와 40℃ 이하에서 안정하였으며 효소활성은 금속이온에 의해 영향을 받지 않았고 2 mM의 phenylmetanesulfonyl fluoride에 의해 86% 실활되었다. 이 결과로부터 본 효소는 효소활성부위가 serine의 OH기인 serine protease인 것으로 밝혀졌다.
- 활성 분획물을 SDS-PAGE한 결과, Fig. 4에서와 같이 단일 밴드가 검출되어 정제 단백질임이 확인되었으며 본 효소의 분자량은 32 kDa인 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 메주에서 분리한 Syn.
- 활성단백질을 동결건조한 후, 전량을 20mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)으로 평준화시킨 Sephadex G-100 칼럼에 전량(738 mg/3 mL)을 충진시킨 다음, 36.2 mL/hr의 유속으로 7 mL씩 분획한 결과, Fig. 2에서와 같이 두 개의 peak가 검출되었고 14~36번 사이의 분획에서 효소활성이 검출되었으며, 14~30번을 활성단백질로서 분획하였다. 이때의 비활성도는 190.
- 효소활성에 미치는 온도의 영향을 조사한 결과, Fig. 6과 같이 최적온도는 50℃였으며 50℃ 이상에서 점차 효소활성이 감소하였다. Asp.
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