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문제 정의
- 즉, 지용성 저해제가 수용성인 tyrosinase 활성을 저해하는 효과를 분석하기 위해서 먼저 중요한것은 지용성 물질과 수용성인 효소를 단일 상(phase) 에 용해시키는 것인데, 최근에 한 등(10)은 역미셀계를 도입함으로써 유기용매에서 tyrosinase 저해활성을 분석할 수 있는 반응계를 고안하였다. 본 연구는 이 방법에 따라 유기용매계면활성제/물로 구성된 역미셀계에서의 tyrosinase 반응을 이용하여, 식물체의 지용성추출물이 동 효소를 저해하는 효과를 조사하여 비교한 결과이다.
- 그리고 각 식물체의 tyrosinase 저해효과와 더불어 추출수율을 함께 고려했을 때, 단위 원재료로부터 tyrosianse 저해제 생산을 많이 할 수 있는 소재를 선정할 수 있었다. 본 연구에서는 역미셀계를 이용함으로서 기존에는 분석이 어려웠던 지용성 물질의 tyrosinase 저해효과를 측정할 수 있었다.
제안 방법
- 200 mM의 AOT 함유 isooctane 용액 1.5 mL에 지용성 추출물 2% 함유 isooctane 용액 1.5 mL# 혼합한 후, 인산완충액(20 nN, pH 8.0H 20 mM 농도로 용해된 DOPA 용액 27 μL와 tyrosinase 용액 27 μL(3,900 imits/mL)를 차례로 첨가하여 isogane/AOT/인산 완충액으로 구성된 광학적으로 투명한 역미셀계를 형성하였다. 이때 유기용매를 포함한 전체 반웅계에서 AOT 농도는 100 mM, DOPA 농도는 0.
- DOPA의 갈변화가 일어남을 확인하였다. 본 연구에서는 한 등이 제시한 역미셀계 형성 조건을 활용하여 petroleum etherS. 추출한 지용성 물질의 tyrosinase에 대한 저해효과를 분석하였다.
- 3 units, 추출물 농도는 1%였다. 이 반웅계에서 지용성 추출물이 tyrosinase 활성을 저해하는 효과를 분석하기 위해 분광광도계 (Beckman, DU-7, U.S.A.)를 이용하여 반응시간에 따른 475 nm에서의 흡광도 변화 (S^)를 분석하였다. 그리고 효소액 대신에 중류수 27 μL를 첨가하여 측정한 흡광도 변화값(Babs) 및 지용성 추출물을 함유하지 않는 isooctane 1.
- 체내에서 멜라닌 생합성을 촉매하는 tyrosinase에 대한 천연의 지용성 저해제 발굴을 위하여, isooctane/ AOT(l00mM)/인산완충용액 (20mM, pH 8.0)으로 구성되고 tyrosinase(105.3 units/mL)와 3,4-dihydroxyphenylalanine(0.18mM)을 함유한 역미셀계에서 식물체 75종 의 petroleum ether 추출물이 tyrosinase 반응을 억제하는 효과를 분석하였다. 조사대상 식물체중에서 마늘이 in vitro 멜라닌 합성 반응을 완전히 저해하였고(100%), 모과, 고구마, 양파, 무순, 사과의 저해활성이 60% 이상이었다.
- 본 연구에서는 한 등이 제시한 역미셀계 형성 조건을 활용하여 petroleum etherS. 추출한 지용성 물질의 tyrosinase에 대한 저해효과를 분석하였다.
대상 데이터
- Mushroom tyrosinase(4,400 units/mg solid) 및 3, 4-dihydroxyphenylalanine(DOPA), dioctyl sulfosuccinate (AOT), sodium phosphate, 4-hexylresorcinol, cinnamic acid는 Sigma사, isooctane은 Burdick & Jackson사 (HPLC 급), petroleum ether는 Showa Chemicals, sodium sulfate anhydrous는 Shinyo Pure Chemicals, absolute alcohol은 Hay mar사로부터 구입 하여 사용하였고 기타 시약은 analytical 등급을 이용하였다.
- 실험에 사용한 채소류, 과일류, 버섯류는 신선한 상태로, 다류, 야용식물, 초본류는 건조물의 상태로 시중에서 구입하여 사용하였다. 신선한 상태의 재료는 구입 후 즉시 사용하였고, 약용식물 및 초본류는 -20℃ 냉동저장, 다류는 상온에 저장하면서 필요시 사용하였다.
성능/효과
- 1)Laurel(Cinnamomum camphora) and sage(SaZvia officinalis) showed negative value in inhibition effect(%).
- 1)Spectrophotometrical assay to evaluate the inhibition effect of lipophilic extracts obtained from some plants such as red chicory(Cichonum intybus), small green omon(AUoum fistulosum), parsley(Petrvselnum sativum), crown daisy(Chrysanthemum corocnarium), celery(Apiwn graveolens), spinach(5prna:to maxima), squash pumpkin(Cucurbita mosch), persimmon(Diospuros kaki) and tomato(Solanum lycopersicum) was difficult due to dense color of extracts which prevent the accurate measurement of absorbance change at 475nm.
- 2)4-Hexylresorcinol and cinnamic acid were used as standard materials with ability to inhibit tyrosinase activity in reverse micelles composed of isooctane/AOT/phosphate buffer⑷.
- 각 식물체들의 추출수율을 비교하여 보았을 때 약용식물에서는 오미자 12.01%, 오매 9.33%, 원지 6.88%가 높은 추출수율을 보였고, 초본류에서는 정향 12.48%, 고수 9.83% 등이 수율이 높았다. 야용식물 및 초본류에서 추출수율과 tyrosinase 저해효과를 함께 고려했을 때 고수, 정향, 로즈마리, 오매, 오미자 등이 단위 원재료당 tyrosinase 저해제 생산량이 높은 것으로 판단되었다.
- 35%로 비교적 높게 나타났다. 과채류에서는 홍고추가 0.66%, 늙은 호박이 0.52%였으며, 아보카도는 12.97%로 과일류 뿐 아니라 조사대 상전 채소, 과일, 다류 및 버섯류 중에서 가장 높은 추출 수율을 보였다. 식물체로부터 tyrosinase 저해 효과를 지닌 지용성 추출물의 경제적인 생산을 고려한다면 저해 효과와 추출수율이 모두 높은 원료가 최적일 것으로 여겨지는데 엽경채류에서는 무순, 근채류에서는 마늘, 과실류에서는 아보카도가 최적인 것으로 나타났다.
- 한약재와 향신료 중에서는 로즈마리, 고수, 계피, 산사자, 측백엽, 오매, 두충, 박하, 정향이 60% 이상의 저해능을 보였다. 그리고 각 식물체의 tyrosinase 저해효과와 더불어 추출수율을 함께 고려했을 때, 단위 원재료로부터 tyrosianse 저해제 생산을 많이 할 수 있는 소재를 선정할 수 있었다. 본 연구에서는 역미셀계를 이용함으로서 기존에는 분석이 어려웠던 지용성 물질의 tyrosinase 저해효과를 측정할 수 있었다.
- 그러나 쪽파, 파슬리, 쑥갓, 셀러리, 시금치는 자체의 chlorophyll 색소에 기인한 색이 너무 짙어서, 레드치커리는 반응이 안정적으로 일어나지 않아서 측정이 어려웠으며, 다류에서 녹차와 홍차도 추출물 자체의 색이 너무 짙어 측정이 곤란하였다. 근채류 중에서는 마늘이 tyrosinase 활성을 완전히 저해(100%)하였으며 고구마 70%, 양파 69%, 도라지 56% 순으로 효과가 높았다. 고구마와 도라지의 수용성 추출물은 수용성 분석계에서 추출물자체의 갈변화가 빠르게 진행되어 멜라닌생성 분석 파장인 475 nm의 흡광도 측정을 방해함으로서 효능평가가 어려웠지만13), 지용성 추출물을 역미셀계에서 분석하는 경우 이 같은 문제가 발생하지 않아 효능평가가 가능하였다.
- 97%로 과일류 뿐 아니라 조사대 상전 채소, 과일, 다류 및 버섯류 중에서 가장 높은 추출 수율을 보였다. 식물체로부터 tyrosinase 저해 효과를 지닌 지용성 추출물의 경제적인 생산을 고려한다면 저해 효과와 추출수율이 모두 높은 원료가 최적일 것으로 여겨지는데 엽경채류에서는 무순, 근채류에서는 마늘, 과실류에서는 아보카도가 최적인 것으로 나타났다. 특히 아보카도의 경우 저해효과 자체는 높지 않지만 추출수율이 월등히 높아 단위 원재료로부터 가장 많은 tyrosinase 저해제를 생산할 수 있는 원료로 평가 되었다.
- 83% 등이 수율이 높았다. 야용식물 및 초본류에서 추출수율과 tyrosinase 저해효과를 함께 고려했을 때 고수, 정향, 로즈마리, 오매, 오미자 등이 단위 원재료당 tyrosinase 저해제 생산량이 높은 것으로 판단되었다. 한편, 조사된 식물체중에서 야용식물 및 초본류 등 건조된 상태의 식물체가 채소, 과일류 등의 생물에 비해 전반적으로 추출수율이 높게 나타났는데, 이는 생물에 존재하는 수분이 petroleum etherS- 추출 중에 추출용매계의 극성에 영향을 주어 지용성 물질의 추출에 영향을 주기 때문으로 여겨졌다.
- 저해효과의 평가기준 물질로서 tyrosinase에 대한 저해효과가 알려진 4-hexy [resorcinol과 cinnamic acid(4)를각각 0.5mM 농도로 역미셀 반응계에 첨가한 결과 tyrosinase 활성을 각각 46%와 93%까지 억제할 수 있었다 (Table 1).
- 18mM)을 함유한 역미셀계에서 식물체 75종 의 petroleum ether 추출물이 tyrosinase 반응을 억제하는 효과를 분석하였다. 조사대상 식물체중에서 마늘이 in vitro 멜라닌 합성 반응을 완전히 저해하였고(100%), 모과, 고구마, 양파, 무순, 사과의 저해활성이 60% 이상이었다. 한약재와 향신료 중에서는 로즈마리, 고수, 계피, 산사자, 측백엽, 오매, 두충, 박하, 정향이 60% 이상의 저해능을 보였다.
- 조사대상 채소류를 가식부위에 따라 엽경채류, 근채류, 과채류로 분류하여 효능을 비교한 결과, 엽경채류에서는 무순이 69%로 가장 높은 저해활성을 나타냈으며 양상치 41%, 알팔파 40%, 브로콜리 32% 순이었다 (Table 1). 그러나 쪽파, 파슬리, 쑥갓, 셀러리, 시금치는 자체의 chlorophyll 색소에 기인한 색이 너무 짙어서, 레드치커리는 반응이 안정적으로 일어나지 않아서 측정이 어려웠으며, 다류에서 녹차와 홍차도 추출물 자체의 색이 너무 짙어 측정이 곤란하였다.
- 조사된 약용식물류 중에서는 계피가 84%로 가장 높은 저해능을 보였고 산사자 76%, 측백엽 73%, 오매71%, 두충 64%, 영지 57%, 산약 51%의 순서로 높은 저해효과를 보였다(Table 2). 특히, 이들 중에서 오매, 계피, 측백엽은 수용성 추출물도 각각 81%, 81%, 63% 의 높은 저해효과가 있음이 보고된 바 있어13) tyrosinase 저해소재로의 이용측면에서 유리한 것으로 나타났다.
- 과채류에서 도청 고추가 고구마, 도라지 등과 마찬가지로 수용성 추출물이 갈변도가 높아 효능분석이 어려웠으나13) 지용성 추출물은 역미셀계의 이용으로 효능평가가 가능하였고 45%의 저해효과를 나타냈다. 즉 이 같은 품목들의 경우에 수용성 부분이 tyrosinase 저해효과를 지니는지 기존 방법으로는 알 수가 없었으나 역미셀계를 이용한 분석을 통해 지용성 부분이 높은 tyrosinase 저해 효과를 지니고 있음을 확인할 수 있었다. 이는 현재 일반적으로 활용되고 있는 수용성 분석계에 의한 조사에 의해 특정소재의 수용성 성분이 효과가 없는 것으로 분석되거나 또는 분석상의 어려움으로 그 효과를 밝히기 어렵더라도13) 지용성 부분에 대해서는 역미셀계를 이용하여 효능평가가 가능함을 의미하는 것이다.
- 추출수율면에서는 엽경채 및 다류에서 녹차의 수율이 0.89%로 가장 높았으며 다음으로 무순, 쪽파, 꽃양배추 등의 수율이 높게 나타났고 근채류에서는 생강이 0.61%, 마늘이 0.35%로 비교적 높게 나타났다. 과채류에서는 홍고추가 0.
- 조사대상 식물체중에서 마늘이 in vitro 멜라닌 합성 반응을 완전히 저해하였고(100%), 모과, 고구마, 양파, 무순, 사과의 저해활성이 60% 이상이었다. 한약재와 향신료 중에서는 로즈마리, 고수, 계피, 산사자, 측백엽, 오매, 두충, 박하, 정향이 60% 이상의 저해능을 보였다. 그리고 각 식물체의 tyrosinase 저해효과와 더불어 추출수율을 함께 고려했을 때, 단위 원재료로부터 tyrosianse 저해제 생산을 많이 할 수 있는 소재를 선정할 수 있었다.
- 야용식물 및 초본류에서 추출수율과 tyrosinase 저해효과를 함께 고려했을 때 고수, 정향, 로즈마리, 오매, 오미자 등이 단위 원재료당 tyrosinase 저해제 생산량이 높은 것으로 판단되었다. 한편, 조사된 식물체중에서 야용식물 및 초본류 등 건조된 상태의 식물체가 채소, 과일류 등의 생물에 비해 전반적으로 추출수율이 높게 나타났는데, 이는 생물에 존재하는 수분이 petroleum etherS- 추출 중에 추출용매계의 극성에 영향을 주어 지용성 물질의 추출에 영향을 주기 때문으로 여겨졌다.
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