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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 인간의 건강을 유지하거나 질병을 치료하기 위하여 옛부터 전통적으로 사용되어 그 안전성이 확인된 38종의 생약재에 대하여 항산화력을 탐색하였으며 이중 항산화 활성이 높고 민간요법으로 골다공증 치료에 효과가 있다고 하는 홍화씨에 대하여 활성물질을 추적하여 분리된 물질의 구조를 확인하였고 천연 항산화제로서 의 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- 80% MeOH로 추출한 홍화씨 추출액을 회전농도기에 넣고 농도를 각각 60㎍/ml, 30㎍/ml, 15㎍/ml로 달리하여 DPPH 방법으로 항산화활성을 검정한 결과 control 1.63에 비해 EtOAc 분획물과 n-BuOH 분획물이 H2O 분획물보다 활성이 높게 나타나 본 시험에서는 EtOAc 추출물에서 얻어진 분획 을 사용하여 다음 그림 2와 같이 분리동정 하였으며, 각 분획들에 대한 DPPH radical소거 활성 을 측정하였다.
- 1H-NMR(400MHz) , 13C-NMR(lOOMHz), DEPT. UV흡수는 Shimadzu UV-1601 UV-spectrophotometer로 측정하였다.
- 각 생약재로부터 분리추출된 EtOAc 분획물을 헥산과 EtOAc 10 : 1용액에 용해시켜 실리카겔 칼럼으로 통과시킨후 순차적으로 5 : 1, 3 : 1, 2 : 1의 비로 만든 헥산과 EtOAc용액을 실리카겔 칼럼에 통과시켜 시험관에 70ml씩 분취하였다. 이것을 TLC로 확인하는데 이때 전개용매는 클로로포름과 에탄올의 비를 10 : 1로 만들어 전개시켰고 전개된 물질의 높이가 같은 분획끼리 합하여 농축한 후 DPPH방법으로 활성을 검정 해가면서 활성물질을 추적분리 하였다.
- 용해하였다. 각 시료 용액 80μl를 시험관에첨가한 후 1.5×10-4M DPPH 5ml씩 가하여 vortex mixer로 잘 섞고 교반한 후 실온에서 30분간 반응시킨 다음 Spectrophotometer (Model Varian Cary 3, USA) 로 흡광도 517nm에서 DPPH radical 소거 활성을 검색하여 활성을 측정하였다. 각 실험은 2회 반복하여 수행하였으며, 대조용 실험은 각 시료 대신에 80μl를 취한 후 동일한 방법으로 실시하였다.
- 5×10-4M DPPH 5ml씩 가하여 vortex mixer로 잘 섞고 교반한 후 실온에서 30분간 반응시킨 다음 Spectrophotometer (Model Varian Cary 3, USA) 로 흡광도 517nm에서 DPPH radical 소거 활성을 검색하여 활성을 측정하였다. 각 실험은 2회 반복하여 수행하였으며, 대조용 실험은 각 시료 대신에 80μl를 취한 후 동일한 방법으로 실시하였다.
- 공시된 생약재를 각각 30g씩 50℃ 열풍건조기에서 건조하여 미세하게 분쇄한 후 그림 1과 같이 80% MeOH수용액에 1일간 실온에서 추출한 후 여지로 여과한 다음 rotary evaporator에 넣고 45℃에서 감압농축 시켰으며 이것을 분액여두에 넣고 EtOAc와 증류수를 동량으로 섞고 분배 추출한 후 비극성물질은 EtOAc층으로 극성물질은 H2O층으로 계통분획 하여 DPPH방법으로 활성을 검정 하였다.
- 이것을 TLC로 확인하는데 이때 전개용매는 클로로포름과 에탄올의 비를 10 : 1로 만들어 전개시켰고 전개된 물질의 높이가 같은 분획끼리 합하여 농축한 후 DPPH방법으로 활성을 검정 해가면서 활성물질을 추적분리 하였다.
- 이상의 결과 항산화 활성이 확인된 13종의 생약재중 항산화활성과 관련하여 아직까지 연구가 이루워진 바가 없는 홍화씨에 대하여 활성물질을 추적 분리동정 하였다.
대상 데이터
- 본 시험에 사용한 공시재료는 항산화활성 관련 및 질병치료의 목적으로 이용되어온 국내에서 생산된 생약재 38종을 작물시험장 특용작물과에서 추천한 약재상(서울 경동시장)에서 구입하여 분쇄기 (Pin type, 4,500 rpm, 3. 7㎾)로 분쇄한 후 80% MeOH수용액으로 추출한것을 4℃에 저장하면서 실험에 사용하였다. 1H-NMR(400MHz) , 13C-NMR(lOOMHz), DEPT.
성능/효과
- DPPH (1, l-diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 최대 흡광파장을 결정하기 위하여 800~200㎚ 까지 파장을 달리하여 홉광도를 측정한 결과 517㎚에서 최대 흡광도를 나타냈으며, 활성측정을 위한 DPPH의 적정농도를 결정하기 위하여 1×10-5~4×l0-4까지의 표준시료를 사용하여 흡광도를 측정한 결과 1.5×10-4M에서 안정적인 최대치를 나타내었다.
- 처음 밝혀냈다. DPPH radical소거 활성에 의한기존 항산화제인 a-tocopherol, BHA 및 BHT를 N-feruloylserotonih과 항산화력를 비교한 결과 N-feruloylserotonin이 6.6㎍/ml로 활성이 가장높은 것으로 밝혀졌다.
- 102로 가장 높았다. 따라서 활성이 집중된 CTS-E-8-6-2-3의 소분획을 NMR로 data를 해석한 결과 N- feruloylserotoin으로 동정되었다.(H.
- 선발된 13종의 생약재중 홍화씨에 대한 활성물질을 추적, 분리하여 NMR로 물질구조를 동정한 결과 N-feruloylserotonin이 항산화 물질이라는 것을 처음 밝혀냈다. DPPH radical소거 활성에 의한기존 항산화제인 a-tocopherol, BHA 및 BHT를 N-feruloylserotonih과 항산화력를 비교한 결과 N-feruloylserotonin이 6.
- 천연물로부터 새로운 항산화물질을 구명하기 위하여 국내에서 생산된 약용작물 38종을 수집하여 항산화 활성물질을 탐색한 결과 가시오갈피, 구절초, 건강, 목단, 시호, 산수유, 삼백초, 산사, 유근피, 작약, 천궁, 홍화씨, 및 황금등 13종이 항산화 활성이 높은 생약재로 선발되었다.
- 표 2는 생약재 38종의 EtOAc 및 H2O 분획에 대하여 DPPH radical소거 활성 측정 결과로서 EtOAc로 추출한 분획물에서는 가시오갈피, 구절초, 건강, 목단, 시호, 산수유, 산사, 유근피, 작약, 천궁, 홍화씨 및 황금등이 20㎍/ml이하로 항산화 활성이 있는 것으로 측정 되었으며 특히 목단, 산수유, 유근피, 작약등은 18.8~6㎍/ml으로 활성이 높게 검출되었다.
- 표 5는 현재 식품 또는 공업용에 가장 많이 사용하고 있는 합성항산화제인 BHT와 BHA 그리고 천연 항산화제인 a-tocopherol을 N-feruloylserotonin 대하여 DPPH radical소거 활성을 비교시험한 결과로서 N-feruloylserotonin이 6㎍/ml로 활성이 가장 높은 것으로 밝혀졌다.
- 한편 물로 추출한 분획물중 구절초, 시호, 산수유, 산사, 천궁, 홍화씨 및 황금등은 200㎍/ml 이상으로 물층에서는 항산화 활성이 없었으나, 삼백초는 오히려 물층에서 항산화 활성이 있고 EtOAc 충에서 활성이 없는 것으로 나타났다.
- 홍화씨로 부터 추출하여 얻어진 EtOAc 분획물을 silica gel column chromatography에 통과시켜 70ml씩 분취하였고 각 분취액을 박층크로마토 그라피로 확인하여 유사한 분획끼리 합하고 농축하여 9개의 소분획물을 얻어 이들에 대한 DPPH radical소거 활성을 측정한 결과 CTS-E-8분획이 0.432로 활성이 가장 높아 이것을 다시 silica gel column 난iromatography를 통과시켜 9개의 소분획을 얻었는데 이중 CTS-E-8-6분획이 0.468로 활성이 가장 높았다.
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