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문제 정의
- 본 연구는 오배자로부터 분리한 5종의 화합물 즉 syringic acid, gallic acid methylester, protocatechuic acid, gallic acid 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose에 대하여 항산화 및 간보호 효과에 대해 검토한 결과 다음과 같은 지견을 얻었기에 보고하고자 한다.
- 활성산소에 기인하는 다양한 성인병을 예방 치료할 수 있는 안전하고 우수한 항산화 물질을 천연물로 부터 개발하기 연구의 일환으로 오배자의 주성분에 대한 항산화효과 및 간보호효과를 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
가설 설정
- b) N. D ： Not detennined.
제안 방법
- al.(2000)이 보고한 실험방법에 준하여 음건한 오배자를 추출용기 에 넣고 MeOH로 3회 환류 추출하여 얻어지는 용액을 농축하여 오배자 MeOH 엑스를 얻었고, 이를 n-hexane과 H2O 1 : 1로 분배하여 얻어지는 n-hexane 용액을 농축하여 n-hexane 엑스를 얻었다. 계속하여 얻어진 H2O 층에 EtOAc 용액을 H2O 층과 1 : 1이 되게 가한 후 분배하여 얻어지는 EtOAc용액을 농축하여 EtOAc 엑스를 얻고 잔여의 H2O 층에 n-BuOH을 H2O 층과 1 : 1이 되도록 가한 후 분배시켜 얻어지는 n-BuOH 용액과 H2O 층을 농축하여 n-BuOH 엑스와 H2O 엑스를 각각 얻었다.
- 51g)의 EtOH(100ml) 용액〕(2. 0ml), 0. 05 M 인산완충액(pH 7. 0, 4. 0ml), 증류수(1. 9ml) 및 10% Tween 20(0. 1ml)을 20ml의 시험관에 생약의 최종농도가 0.005%가 되도록 전량을 10ml로 하여 40℃의 암소에 방치하였다. 이 시료 0.
- EtOAc 엑스도 silica gel을 이용하여 흡착시킨 후 용매를 단계적으로 사용하여 분리하여 gallic acid methylester, protocatechuic acid 및 gallic acid를 얻었다. 계속하여 n-BuOH 엑스를 silica gel에 흡착시킨 후 용매를 순차적으로 사용하여 1차 분리한 후 MeOH를 용매로 하여 역상 colum chromatography를 실시하여 1, 2, 3, 4, 6- penta-O-galloyl-β-D-glucose 등의 오배자 주성분을 단리 하여 시료로 사용하였다.
- 하였다. 대조군의 수치를 100으로 환산하여 BHA를 비교군으로 하여 분리 동정한 5종 화합물을 실험군으로 하여 MDA의 억제활성을 측정하였고 이때 비교군인 BHA와 모든 시료는 1.6×10-6, 1.6×10-5, 1.6×100-4의 3가지 농도(Mole)로 첨가를 하여 각 농도별 MDA의 억제활성을 백분율로 표시하였다. 그 결과 표 2에 나타낸 바와 같이 오배자의 n-hexane 분획물에서 분리 동정한 syringic acid의 MDA의 억제활성은 1.
- 배양 두 시간 후 serum-free WME 배양액으로 2번 세척하여 well에 부착되지 않은 세포들을 제거하고 처리용액(Glycyrrhizin, CCl3, CCl4+시험액 등)을 포함한 새로운 WME 배양액을 첨가하여 CO2 incubator에 넣고 37℃에서 90분간 배양한다. 배양 후 배양액을 채취하여 glass test tube에 옮김 다음 4℃에서 3,000rpm으로 5분간 원심분리 한 후 상등액을 취하여 GOT, GPT를 측정 하였다.
- 6ml를 가하고 98℃ 수욕상에서 1 시간 동안 가열했다. 실온으로 식힌 후 부탄올 4ml를 가하여 진탕하고 10분간 원심분리(RPM/3000)하여 부탄올층을 취하여 534nm에서 생성되는 MDA(malondialdehyde)량을 측정하였다. 가해진 TBA 시약은 thiobarbituric acid 0.
- 오배자 주성분 5종의 화합물을 BHA를 비교군으로 하여 TBA정색 반응법에 의한 과산화 지질의 생성의 지표인 MDA를 534nm(UV)에서 측정하여 MDA 억제효과에 의한 항산화효과를 측정 하였다. 대조군의 수치를 100으로 환산하여 BHA를 비교군으로 하여 분리 동정한 5종 화합물을 실험군으로 하여 MDA의 억제활성을 측정하였고 이때 비교군인 BHA와 모든 시료는 1.
대상 데이터
- Ferrous chloride, Tween 20, EtOH, CCU 등은 모두 특급시 약을 사용하여 측정하였다. 간보호 GOT, GPT 측정용 kit는 아산제약(AM 101-K) 시약을 사용하였다. 표준품인 tocopherol 및 BHA(Butylated hydroxyanisole)은 Sigma사 제품을 구입하여 사용하였고, 기타 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였으며 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV spectrophotometer를 사용하여 측정 하였다.
- 간보호 GOT, GPT 측정용 kit는 아산제약(AM 101-K) 시약을 사용하였다. 표준품인 tocopherol 및 BHA(Butylated hydroxyanisole)은 Sigma사 제품을 구입하여 사용하였고, 기타 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였으며 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV spectrophotometer를 사용하여 측정 하였다.
- 항산화효과 측정 용 시 약인 linoleic acid, ammonium thiocyanate는 Aldrich사 제품을 구입 하여 사용하였고, TBA 시약인 thiobarbituric acid, sodium dodecyl sulfate는 Sigma사 제품을 구입하여 사용하였다. Ferrous chloride, Tween 20, EtOH, CCU 등은 모두 특급시 약을 사용하여 측정하였다.
이론/모형
- Table 2. Antioxidative effect of compounds isolated from Galla Rhois using TBA method.
성능/효과
- 1. Ferric-Thiocyanate 법에 의하여 과산화반응 억제에 따른 항산화 활성을 측정한 결과 모두 tocopherol보다 강한 과산화반응 억제 활성을 보였으며 gallic acid methyl ester, protocatechuic acid와 syringic acid는 tocopherol 보다는 강한 활성을 보였으며 BHA와는 유사 또는 그 이상의 활성을 보였다. 특히 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose는 tocopherol과 BHA보다 매우 강한 과산화반응 억제 활성을 보였다.
- 2. TBA 법에 의한 과산화 지질의 생성의 지표인 MDA 억제효과에 의한 항산화효과를 측정한 결과 gallic acid는 1.6×10-4의 농도에서 BHA보다 높은 억제율을, protocatechuic acid는 1.6×10-6의 농도에서 BHA보다 높은 억제율을 보였다. gallic acid meth피 ester와 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose는 농도가 증가함에 따라 우수한 MDA의 억제활성을 나타내었다.
- 3. Glycyrrhizin을 비교군으로 하여 간 보호 실험을 한 결과 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-ghicose의 0. 5mg/ml첨가군에서는 GOT의 강한 감소 효과를 보였으며 GPT 실험에서는 각 시료 0.
- 6×100-4의 3가지 농도(Mole)로 첨가를 하여 각 농도별 MDA의 억제활성을 백분율로 표시하였다. 그 결과 표 2에 나타낸 바와 같이 오배자의 n-hexane 분획물에서 분리 동정한 syringic acid의 MDA의 억제활성은 1.6×10-6, 1.6×10-5의 농도 첨가시에는 활성이 없었으나 1.6×10-4 농도로 첨가 시에는 약간의 활성이 보였다. 오배자의 EtOAc 분획물에서 분리 동정한 gallic acid methyl ester, gallic acid, protocatechuic acid 및 오배자의 BuOH 분획물에서 분리 동정한 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose의 MDA의 억제활성은 농도가 올라감에 따라 점차 활성이 증가함을 보였으며 gallic acid는 1.
- 따라서 오배자는 이미 알려진항암효과, 장내세균에 대한 억제효과 및 항당뇨에 대한 효과와 더불어 본 연구에서 명확히 밝힌바와 같이 탁월한 항산화 효과 및 간보호효과를 가진 주성분을 함유한 약용식물임이 밝혀짐에 따라 다양한 성인병 예방 및 치료제로 개발 가능한 중요자원임을 알 수 있었다.
- 따라서, 오배자로부터 단리된 5종 화합물은 천연 항산화제인 tocopherol보다는 우수하고 합성 항산화제인 BHA와는 유사 또는 우수한 항산화 효과를 나타내었고, 간보호 효과에서도 우수한 효과를 발휘하였다. 따라서 오배자는 이미 알려진항암효과, 장내세균에 대한 억제효과 및 항당뇨에 대한 효과와 더불어 본 연구에서 명확히 밝힌바와 같이 탁월한 항산화 효과 및 간보호효과를 가진 주성분을 함유한 약용식물임이 밝혀짐에 따라 다양한 성인병 예방 및 치료제로 개발 가능한 중요자원임을 알 수 있었다.
- 오배자의 EtOAc 분획물에서 분리 동정한 gallic acid는 tocopherol 보다는 강한 활성을 보였으나 BHA보다는 다소 활성이 약하였다. 또한 오배자의 EtOAc 분획물에서 분리 동정한 gallic acid methyl ester, protocatechuic acid와 오배자의 n-hexane 분획물에서 분리 동정한 syringic acid는 tocopherol 보다는 강한 활성을 보였으며 BHA와는 유사 또는 그 이상의 활성을 보였다. 특히 오배자의 BuOH 분획물에서 분리 동정한 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose는 비교군으로 사용한 tocopherol과 BHA보다 매우 강한 과산화반응 억제 활성을 보였다.
- 오배자로부터 분리 동정한 5종의 오배자 주성분 화합물을 tocopherol과 BHA를 비교군으로 하여 Ferric-Thiocyanate법에 의한 항산화효과 실험을 실시한 결과 5종 화합물의 과산화반응 억제 활성은 표 1과 그림 1에서 나타낸 것과 같이 tocopherol보다는 강한 과산화반응 억제 활성을 보였다. 오배자의 EtOAc 분획물에서 분리 동정한 gallic acid는 tocopherol 보다는 강한 활성을 보였으나 BHA보다는 다소 활성이 약하였다.
- 6×10-4 농도로 첨가 시에는 약간의 활성이 보였다. 오배자의 EtOAc 분획물에서 분리 동정한 gallic acid methyl ester, gallic acid, protocatechuic acid 및 오배자의 BuOH 분획물에서 분리 동정한 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose의 MDA의 억제활성은 농도가 올라감에 따라 점차 활성이 증가함을 보였으며 gallic acid는 1.6×10-4의 농도에서 비교군인 합성 항산화제인 BHA보다 높은 억제율을, protocatechuic acid는 1.6×10-6의 농도에서 비교군인 BHA보다 높은 억제율을 보였다. Gallic acid methyl ester와 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose는 농도가 증가함에 따라 급격히 MDA의 억제활성이 증가하였다.
- 오배자의 EtOAc 분획물에서 분리 동정한 gallic acid는 tocopherol 보다는 강한 활성을 보였으나 BHA보다는 다소 활성이 약하였다. 또한 오배자의 EtOAc 분획물에서 분리 동정한 gallic acid methyl ester, protocatechuic acid와 오배자의 n-hexane 분획물에서 분리 동정한 syringic acid는 tocopherol 보다는 강한 활성을 보였으며 BHA와는 유사 또는 그 이상의 활성을 보였다.
- 이는 Yoshikawa et al,((1994)이 보고한 베트남 과실의 과피로 부터 얻어지는 항산화 주성분인 γ- mangostin과 유사한 강력한 항산화효과를 나타내는 것으로 판단된다. 이상의 결과, 오배자에서 분리한 5종의 주성분의 과산화반응 억제 효과에 의한 항산화효과는 오배자의 각 유기용매별 분획물의 Ferric-Thiocyanate법에 의한 항산화 결과와 유사 또는 그 이상의 활성을 보였으므로 분리한 5종의 화합물이 오배자의 활성 성분임을 알 수 있었다.
- Ferric-Thiocyanate 법에 의하여 과산화반응 억제에 따른 항산화 활성을 측정한 결과 모두 tocopherol보다 강한 과산화반응 억제 활성을 보였으며 gallic acid methyl ester, protocatechuic acid와 syringic acid는 tocopherol 보다는 강한 활성을 보였으며 BHA와는 유사 또는 그 이상의 활성을 보였다. 특히 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose는 tocopherol과 BHA보다 매우 강한 과산화반응 억제 활성을 보였다.
- 또한 오배자의 EtOAc 분획물에서 분리 동정한 gallic acid methyl ester, protocatechuic acid와 오배자의 n-hexane 분획물에서 분리 동정한 syringic acid는 tocopherol 보다는 강한 활성을 보였으며 BHA와는 유사 또는 그 이상의 활성을 보였다. 특히 오배자의 BuOH 분획물에서 분리 동정한 1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-D-glucose는 비교군으로 사용한 tocopherol과 BHA보다 매우 강한 과산화반응 억제 활성을 보였다. 이는 Yoshikawa et al,((1994)이 보고한 베트남 과실의 과피로 부터 얻어지는 항산화 주성분인 γ- mangostin과 유사한 강력한 항산화효과를 나타내는 것으로 판단된다.
- 표 3의 결과에서와 같이 control인 CCl4 무첨가군보다 CCl4의 첨가군(7.5mM)에서 GOT, GPT의 수치가 유의성 있게 증가한 것으로 보아 CCl4에 의한 간독성이 유발된 것으로 간주하였다. 오배자에서 분리 동정한 5종 화합물과 감초로부터 분리된 glycyrrhizin(van Rossum et al.
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