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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 저온의 세척조건에서 고활성을 유지하는 alkaline protease를 개발하기 위하여 토양으로부터 세제내성의 alkaline protease 생산균주를 분리, 동정흐}고, 그 효소학적 성질을 검토하였다.
제안 방법
- 0%을 사용하였다. Native PAGE를 통하여 얻은 gel을 protein 분해능을 확인하기 위하여 2.5%의 skim milk가 포함된 molten agarose plate에 겹쳐 37℃에서 30분 간 반응시킨 후 형셩된 active band를 확인하였다.
- 색깔 등을. 관찰하였고, 생리학적 특성으로는 gelatin 액화력,·indole 생성능, nitrate 환원력 및 catalase, oxidase, urease의 생성 유무 등을 조사하였다. 세포벽 구성 성분의 분석은 Komagata13)의 방법에 따라 cellulose TLC plate에 시료를 점적하고 methanol: water: 6 N-HC1: pyridme(80:20:4:10, v/v)을 이동상으로 하여 전개하고 acetonic ninhydrine으로 발색시켜 diaminopimelic acid(DAP) isomer를 분석하였다.
- 균의 생장 정도를 측정하기 위해 배양액을 증류수로 2배로 희석한 후 분광광도계 (Shimadzu, UV120-02)를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 최종 선별은 액체배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 20℃와 40℃ 각각의 조건에서 효소활성을 측정하여 높은 활성과 각 온도에서 고른 활성을 갖는 alkaline protease 생산균주를 분리하였다. 균주는 보관중인 종균배지(sucrose 6%, tryptone 2%, NH4NO3 0.2%, NaCl 0.2%, K2HPO40.1%, MgSO4·7H2O 0.02%, Na2CO3 0.3%, agar 1.5%, DW 11, pH 7.0)에서 백금이로 1 회 취하여 동일 액체배지에 접종하여 20℃에서 24시간 진탕배양한 것을 종균으로 사용하였다.
- 로, Kim 등'"은 Thermoactino-myces sp.로부터 열에 안정한 alkaline protease의 효소 특성을 조사하였다. 또한 Chang 등11)은 Xanthomonas sp.
- 배양시간에 따른 균의 성장과 효소의 생산을 조사하기 위해 protease 생산배지에 분리한 균주를 접종하여 초기 pH를 10.0, 온도는 40℃에서 90시간 진탕배양하면서 균의 증식, pH 변화 및 효소생성량을 측정하였다. Fig.
- 0)에 토양 현탁액을 도말하고 20℃ 배양기에서 4일간 배양한 후 균의 생육이 좋고 큰 halo size 갖는 것을 1차 선별하였다. 선별된 균주를 tooth-pick을 이용하여 동일 배지에 접종하고 성장과 효소활성이 높은 균주를 다시 액체배지에서 20℃, 2일간 진탕배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 agar plate에 구멍을 내어 50μl씩 분주하여 단백질 분해에 의해 생성된 clear zone의 크기가 큰 것을 선별하였다. 최종 선별은 액체배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 20℃와 40℃ 각각의 조건에서 효소활성을 측정하여 높은 활성과 각 온도에서 고른 활성을 갖는 alkaline protease 생산균주를 분리하였다.
- 조효소액은 효소생산 배지 (&-D fructose 1%, soybean meal 2%, K2HPO4 0.2%, MgSO4·7H2O 0.02%, Na2CO3 0.3%, DW 1 I, pH 10.0)에서 20℃ 및 40℃, 36시간 배양한 후 배양액을 원심분리(12, 000rpm)하여 상등액을 사용하였으며, alkaline protease의 활성은 Yamada 등의 변형방법으로 Hammarsten casein을 기질로하여 Delft Unit-assay 법으로 측정하였다. 즉, 0.
- 최종 선별은 20℃와 40℃에서 clear zone 및 배양상등액의 두 조건에서 효소활성이 높게 나타나고, 세포증식이 양호한 KN-27균주를 최종 선발하였다.
- 선별된 균주를 tooth-pick을 이용하여 동일 배지에 접종하고 성장과 효소활성이 높은 균주를 다시 액체배지에서 20℃, 2일간 진탕배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 agar plate에 구멍을 내어 50μl씩 분주하여 단백질 분해에 의해 생성된 clear zone의 크기가 큰 것을 선별하였다. 최종 선별은 액체배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 20℃와 40℃ 각각의 조건에서 효소활성을 측정하여 높은 활성과 각 온도에서 고른 활성을 갖는 alkaline protease 생산균주를 분리하였다. 균주는 보관중인 종균배지(sucrose 6%, tryptone 2%, NH4NO3 0.
- 토양으로부터 세제 내성을 지니면서 alkaline protease를 생산하는 균주를 선별하기 위해 분리용 배지 (yeast extract 0.1%, NaCl 0.5%, detergent 0.2%, skim milk powder 3%, Na2CO3 0.2%, agar 1.5%, DW 11, pH 10.0)에 토양 현탁액을 도말하고 20℃ 배양기에서 4일간 배양한 후 균의 생육이 좋고 큰 halo size 갖는 것을 1차 선별하였다. 선별된 균주를 tooth-pick을 이용하여 동일 배지에 접종하고 성장과 효소활성이 높은 균주를 다시 액체배지에서 20℃, 2일간 진탕배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 agar plate에 구멍을 내어 50μl씩 분주하여 단백질 분해에 의해 생성된 clear zone의 크기가 큰 것을 선별하였다.
이론/모형
- Native polyacrylamide gel 전기영동은 Arvidson 등18)의 방법에 따라 행하였으며 gel의 acrylamide 함량은 7.0%을 사용하였다. Native PAGE를 통하여 얻은 gel을 protein 분해능을 확인하기 위하여 2.
- 세포벽 구성 성분의 분석은 Komagata13)의 방법에 따라 cellulose TLC plate에 시료를 점적하고 methanol: water: 6 N-HC1: pyridme(80:20:4:10, v/v)을 이동상으로 하여 전개하고 acetonic ninhydrine으로 발색시켜 diaminopimelic acid(DAP) isomer를 분석하였다. 또한 DNA염기 성분 중의 G+C mol 함량은 Tamaoka14)의 방법에 따라 HPLC를 사용하여 0.2 M N&HPQ와 acetonitrile(20:1, v/v)을 이동상으로 하여 측정하였다. 이 균주의 동정은 Bergey's manual of systematic bacteriology15)와 Manual for the identification of medical bacteria16)에 준하였다.
- 관찰하였고, 생리학적 특성으로는 gelatin 액화력,·indole 생성능, nitrate 환원력 및 catalase, oxidase, urease의 생성 유무 등을 조사하였다. 세포벽 구성 성분의 분석은 Komagata13)의 방법에 따라 cellulose TLC plate에 시료를 점적하고 methanol: water: 6 N-HC1: pyridme(80:20:4:10, v/v)을 이동상으로 하여 전개하고 acetonic ninhydrine으로 발색시켜 diaminopimelic acid(DAP) isomer를 분석하였다. 또한 DNA염기 성분 중의 G+C mol 함량은 Tamaoka14)의 방법에 따라 HPLC를 사용하여 0.
- 2 M N&HPQ와 acetonitrile(20:1, v/v)을 이동상으로 하여 측정하였다. 이 균주의 동정은 Bergey's manual of systematic bacteriology15)와 Manual for the identification of medical bacteria16)에 준하였다.
성능/효과
- 0, 온도는 40℃에서 90시간 진탕배양하면서 균의 증식, pH 변화 및 효소생성량을 측정하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 균의 성장은 초기 30시간 까지 대수적으로 증가하였으며, 이와 더불어 배양액내의 효소활성이 급격히 증가하여 접종 36시간 경과했을 때 효소 생산량이 3,300 D.U/ml로 최대를 나타내었다. 그 이후 활성이 감소하다가 배양 72시간이었을 때 효소활성이 다시 상승하는 것을 볼 수 있었다.
- 이때 pH의 변화는 배양초기 24시간까지는 큰 변화가 없었으며, 24시간 이 후 pH가 감소하다가 36시간이 지나면서 다시 pH가 상승하였고, 세포성장이 정지기에 도달하게 되었다. 따라서 본 균주의 alkaline protease의 생산에 대한 배양 특성은 균의 성장에 따라 효소를 생산한다는 것을 알 수 있다. 효소의 분비양상이 균의 성의장과 같이 증가하는 것은 효소의 기능이 세포의 성장에 필요한 영양분으로 질소원을 체내로 공급하기 위한 주요 수단이라고 Choi 등8)은 설명하고 있고, 다른 한편 Bacillus sp.
- 0 이후 효소활성이 점점 감소하였다. 또한 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여 pH 4.0에서 pH 13.0까지 위와 같은 buffer로 각각 조절하여 60P에서 30분간 처리하고, 최적 활성 pH인 9.0에서 잔존활성을 측정한 결과 전체적으로 고른 잔존활성을 보여 pH에 의한 활성의 감소를 받지 않는 것으로 나타났다. 이는 최적 활성이 pH 12.
- 또한 분리균주 KN-27의 세포벽 Diaminopimelic acid(DAP)를 분석한 결과 meso-DAP 성분을 갖는 것으로 나타났으며, DNA의 G+C mol 함량은 43.3%를 보였다. 대부분의 Acineto-bacter sp.
- 본 균주가 생산하는 protease의 최적반응 온도를 조사하기 위하여 pH 9.0으로 하여 10℃부터 80℃까지 각각으로 30분간 반응시킨 후 활성을 조사한 결과 Fig. 4와 같이 60℃에서 최적 활성을 보였다. 열에 대한 안정성은 10℃에서 80℃까지 각각의 온도에서 30분간 열처리 후 최적활성온도인 60℃에서 기질과 반응시켜 그 잔존활성을 측정한 결과 40℃까지는 변화가 없었으며 60℃ 이상에서는 불안정하였다.
- 본 균주가 생산하는 protease의 최적작용 pH를 조사하기 위하여 pH 4.0-50 범위는 100mM citrate, 6.0은 100 mM phosphate, 7.0~9.0은 100 mM Tris-Cl, 10.0-11.0은 sodium borate 및 12.0~13.0은 NaOH-KCl buffer를 사용하여 60℃에서 30분간 반응시켜 그 활성을 측정한 결과 Fig. 3와 같이 pH 9.0에서 최적작용을 나타냈으며 pH 10.0 이후 효소활성이 점점 감소하였다. 또한 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여 pH 4.
후속연구
- YL-37의 최적온도 중 20℃에서 약 40%의 활성을 나타내어 저온세제용 효소로 이용 가능성이 높다고 판단한 바 있다. 이로 보아 본 균주의 경우도 우리나라 및 동, 북아시아의 세탁조건에 맞는 세제용 효소로서 이용가능 할 것으로 생각된다.
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