선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 선행연구를 통해 토양에서 분리, 동정한 효소 생산균주로부터 호알칼리성 protease의 최적생산조건을 수립하고, 생산하여 해당효소를 정제하고 특성을 알아보았다.
제안 방법
- Bacillus sp. DK1122가 생산하는 알칼리성 단백질 분해 효소를 분리, 정제하기 위하여 효소 최적 생산조건에서 균체를 배양하였다. 배양 후 균체를 원심분리시켜 회수한 배양 상등액으로부터 효소 단백질을 침전하기 위하여 ammonium sulfate 농도를 달리하여 효소 침전 조건을 검토하였다.
- 5% (v/v)를 접종하여 40℃, 250 rpm으로 24시간 진탕 배양하여 배양액 내의 생육도와 효소활성을 측정하였다. NaCl의 영향을 검토하기 위하여 Horikoshi I 배지에 0.5% (w/v) glucose를 첨가하고 pH 9.0으로 조정하여 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20% (w/v) NaCl를 각각 첨가한 배지를 제조하였다. 여기에 종배양액 0.
- Protease 활성은 azocasein법을 변형하여 사용하였다[24]. 효소의 기질로 azocasein (Sigma, USA)을 최종농도 2% (w/v)로 10 mM sodium phosphate buffer (pH 9.
- 균체 생육에 미치는 온도의 영향을 검토하기 위하여 20 ml의 Horikoshi I 배지에 종배양액을 0.5% 접종한 다음 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50℃ 조건에서 250 rpm으로 24시간 진탕 배양한 후 균체의 생육도와 배양액 내의 효소활성을 측정하였다. 배양시간에 따른 균체의 생육과 효소 생산성을 검토하기 위하여 20 ml Horikoshi I 배지에 종배양액 0.
- 균체의 생육과 효소 생산에 미치는 탄소원의 종류와 농도에 따른 영향을 검토하기 위해 Horikoshi I 배지(pH 9.0)에 1% (w/v) glucose 또는 glucose 대신 maltose, lactose, sucrose, dextrin, xylose, galactose, fructose, starch를 각 1% (w/v) 농도로 배지에 첨가하여 종배양액 0.5% (v/v)를 접종한 후 40℃, 250 rpm에서 24시간 진탕 배양하면서 생육과 효소활성을 측정하였다. 이 중 생육과 효소활성이 가장 좋은 탄소원을 선별하여 Horikoshi I 배지에 0.
- 배양 시간에 따른 효소 생산을 검토하기 위하여 40℃, 250 rpm으로 진탕배양 후 배양액을 4시간 간격으로 채취하여 균체의 생육도와 효소 활성을 측정하였다. Fig.
- DK1122가 생산하는 알칼리성 단백질 분해 효소를 분리, 정제하기 위하여 효소 최적 생산조건에서 균체를 배양하였다. 배양 후 균체를 원심분리시켜 회수한 배양 상등액으로부터 효소 단백질을 침전하기 위하여 ammonium sulfate 농도를 달리하여 효소 침전 조건을 검토하였다. 균체를 제거한 상등액에 ammonium sulfate의 포화농도를 각각 50, 70, 80%로 하여 가하고, 4℃에서 4시간 방치하였다.
- 5% (v/v)를 접종한 후 40℃, 250 rpm에서 24시간 진탕 배양하면서 생육과 효소활성을 측정하였다. 이 중 생육과 효소활성이 가장 좋은 탄소원을 선별하여 Horikoshi I 배지에 0.5, 1, 1.5, 2, 5, 10% (w/v) 농도가 되도록 첨가한 배지를 제조하여 사용하였다. 이후, 각 배지에 종배양액 0.
- 9%였다(Table 1). 정제 효소의 순도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 행하였다. 그 결과 정제된 단일 band를 확인하였고, 분자량은 27 kDa로 추정되었다(Fig.
- 정제된 효소의 열안정성을 검토하기 위하여 효소를 0−60℃까지 0−5시간동안 반응시키며 1시간마다 효소활성을 측정하였다. Fig.
- 5% (v/v)를 접종하여 40℃, 250 rpm으로 24시간 진탕 배양하여 균체의 생육도와 효소활성을 측정하였다. 질소원의 영향을 확인하기 위해, 배지 내에 질소원으로 사용하는 yeast extract와 polypeptone을 제거한 후 glucose를 0.5% (w/v) 첨가하여 pH를 9.0으로 조정한 Horikoshi I 배지 20 ml에 yeast extract, polypeptone, bactopeptone, neopeptone, beef extract, tryptone, urea, NH4Cl, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4, NaNO3를 각각 1% (w/v)가 되도록 첨가하였으며, polypeptone과 yeast extract 혼용배지의 경우는 각각 0.5% (w/v) 첨가하여 총 1% (w/v)가 되도록 액체 배지를 조제하였다. 각 배지에 종배양액 0.
대상 데이터
- 선행연구를 통해 토양에서 분리, 동정한 균주, Bacillus sp. DK1122를 protease 생산균주로 사용하였다[25]. 생산배지 최적화의 기본 배양배지는 균주분리에 사용한 Horikoshi I 배지(0.
이론/모형
- )를 이용하여 Bradford 법[7]에 준하여 측정하였다. SDS-PAGE는 Laemmli의 방법[23]에 준하여 행하였다. 전기영동 running gel은 15% (w/v)를 사용하였고 41 mA에서 3시간 전기영동한 후, 0.
- 단백질의 농도는 UV-1201 spectrophotometer (Shimadzu Co.)를 이용하여 Bradford 법[7]에 준하여 측정하였다. SDS-PAGE는 Laemmli의 방법[23]에 준하여 행하였다.
성능/효과
- 따라서 Bacillus sp. DK1122가 생산하는 protease는 산소공급에 따라 효소 활성에 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
- Protease 생산 시, 배양온도의 영향을 확인하기 위해, Horikoshi I 배지를 사용하여 종 배양액을 0.5%씩 접종한 후 배양온도를 20−50℃로 각기 달리하여 250 rpm, 24시간 동안 진탕 배양 후 균체 생육과 효소활성을 측정한 결과, 균체 생육은 25℃에서 서서히 증가하여 40℃에서 최대를 보였으며 45℃ 이상에서는 생육이 이루어지지 않았다(Fig. 1A).
- 균체 생육과 효소 생산에 미치는 질소원의 영향을 검토한 결과 polypeptone과 yeast extract를 혼합하여 첨가한 배지에서 다른 질소원을 첨가했을 때보다 높은 생육과 효소활성을 보였다(data not shown). 각각 yeast extract와 polypeptone의 농도를 변화시키면서 효소 생산을 검토한 결과 yeast extract는 0.8%의 농도에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, polypeptone은 0.5% 농도에서 최대의 효소활성을 보였다(data not shown).
- 균체 생육과 효소 생산에 미치는 질소원의 영향을 검토한 결과 polypeptone과 yeast extract를 혼합하여 첨가한 배지에서 다른 질소원을 첨가했을 때보다 높은 생육과 효소활성을 보였다(data not shown). 각각 yeast extract와 polypeptone의 농도를 변화시키면서 효소 생산을 검토한 결과 yeast extract는 0.
- 1C와 같다. 균체는 pH 7 이상에서 생육하여 pH 9에서 최대 생육을 보였으며 pH 11 이상에서 균체 생육이 급격히 저하됨을 확인하였다. 효소활성은 pH 8 이하와 pH 10 이상에서 현저히 낮았으며, pH 9에서 최대 활성을 나타내었다.
- 1A). 균체로부터의 단백질 분해효소 활성도 40℃에서 최대의 활성을 보였다. 본 균주는 30−40℃의 좁은 온도 범위에서만 생육하며, 배양액 중 효소활성은 40℃에서만 최적의 활성을 보이고 이외의 온도에서는 매우 낮은 활성을 보이므로 이후의 실험에는 배양 온도를 40℃로 하였다.
- 이후 효소액에 CaCl2를 2, 10 mM의 농도로 첨가하여 60℃에서 5시간까지 반응시킨 후 시간대 별로 효소활성을 측정하였다. 그 결과 2 mM 농도에서는 반응 시작부터 급격히 감소하여 5시간까지 50%의 활성을 유지하였으나, 10 mM 농도에서는 3시간 반응시까지 90% 이상의 활성을 유지하였다. 이후 활성이 서서히 감소하여 5시간까지도 60%이상의 효소활성을 보였다.
- 0)에 용해시켜 효소활성을 측정하였으며, 효소량을 구하여 배양 상등액의 효소량과 비교하여 회수율을 계산 하였다. 그 결과 70%의 포화농도에서 가장 높은 효소침전 회수율(41.8%)을 보였다(data not shown). Ammonium sulfate에 의하여 침전시킨 효소 단백질을 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
- 정제 효소의 순도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 행하였다. 그 결과 정제된 단일 band를 확인하였고, 분자량은 27 kDa로 추정되었다(Fig. 2B).
- 효소의 활성에 미치는 반응용액의 pH 영향을 확인하기 위하여 sodium phosphate buffer (pH 5−7), Tris-HCl buffer (pH 7−9), sodium carbonate buffer (pH 9−11)를 10 mM 농도가 되도록 첨가하여 60℃에서 10분간 반응시켰다. 그 결과 효소활성이 pH 7−9의 범위에서 높게 나타났으며 pH 9.0에서 최적의 효소 활성이 나타남을 확인하여 정제된 효소는 alkaline protease로 판명되었다(Fig. 3B).
- 또한 효소활성은 3%의 NaCl 농도에서 최대의 활성을 보였으며, 그 이상의 농도에서는 균체의 생육이 높더라도 활성이 급격히 감소하여 7% 이상의 농도에서는 활성을 거의 찾아볼 수 없었다. 따라서 본 균주는 3% 농도에서 최대의 활성을 갖으며 10%의 염농도에서도 생육하는 내염균(halotolerant)으로 판단되었다. 이전 연구에서 5% NaCl에서 최적성장을 나타내는 Bacillus sp.
- 이전 보고된 호알칼리성 protease의 경우 열안정성은 본 실험의 경우와 비슷하거나[34], 높은 온도에서 최적반응온도[32]나 열안정성[3]을 나타냈다. 따라서 본 효소의 상대적으로 높은 온도에서의 최적활성 및 열안정성은 이후 이를 기반효소로 하여 최적반응온도의 상승 등 효소의 개량을 통해 효소의 이용가능성을 높이기 용이할 것으로 판단된다.
- 본 균주에 있어서 NaCl 농도가 균체 생육과 효소활성에 미치는 영향을 검토한 결과 생육도는 10% NaCl 농도까지 높은 생육을 보였으나 15% 이상에서 급격히 감소하기 시작하여 그 이상의 고농도 염을 첨가하면 균체가 자라지 못하는 것으로 확인되었다(data not shown). 또한 효소활성은 3%의 NaCl 농도에서 최대의 활성을 보였으며, 그 이상의 농도에서는 균체의 생육이 높더라도 활성이 급격히 감소하여 7% 이상의 농도에서는 활성을 거의 찾아볼 수 없었다. 따라서 본 균주는 3% 농도에서 최대의 활성을 갖으며 10%의 염농도에서도 생육하는 내염균(halotolerant)으로 판단되었다.
- 무기염류가 정제된 효소의 열안정성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 열에 불안정한 60℃ 온도에서 효소에 CaCl2나 MgCl2를 첨가하여 활성을 측정한 결과 MgCl2보다 CaCl2에서 효소 활성이 더 오래 지속되는 것을 확인하였다. 이는 Bacillus sp.
- 본 균주에 있어서 NaCl 농도가 균체 생육과 효소활성에 미치는 영향을 검토한 결과 생육도는 10% NaCl 농도까지 높은 생육을 보였으나 15% 이상에서 급격히 감소하기 시작하여 그 이상의 고농도 염을 첨가하면 균체가 자라지 못하는 것으로 확인되었다(data not shown). 또한 효소활성은 3%의 NaCl 농도에서 최대의 활성을 보였으며, 그 이상의 농도에서는 균체의 생육이 높더라도 활성이 급격히 감소하여 7% 이상의 농도에서는 활성을 거의 찾아볼 수 없었다.
- 본 연구를 통해 정제된 호알칼리성 protease는 동일계열의 효소와 비교하여 유사하거나 고유의 특성을 갖고 있는 것으로 나타났다. 높은 온도에서의 열안정성 및 알칼리 내성은 호알칼리성과 열안정성이 요구되는 식품, 세제 및 관련산업에서의 응용성이 매우 높다고 기대된다.
- 효소 생산에 미치는 탄소원의 영향을 검토하기 위하여 배양 후 균체의 생육도와 효소활성을 측정한 결과 glucose를 첨가하였을 때 최대의 생육도와 효소활성을 보였으나, 다른 탄소원에서는 효소활성이 거의 없었다(data not shown). 한편 최대의 활성을 보인 glucose의 농도 변화에 따른 효소의 생산성을 검토하기 위하여 Horikoshi I 배지에 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 5, 10%의 농도의 glucose를 첨가하여 배양한 결과 0.5% glucose농도에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 따라서 이후의 실험에서는 0.
- 효소 생산에 미치는 산소 공급 영향을 검토한 결과 균체의 생육도는 산소의 공급량에 크게 영향을 받지 않고 생육을 보였으나, 효소의 활성에는 산소 공급 조건에 따라 급격한 차이를 나타내었다(Fig. 1D).
- 효소 생산에 미치는 탄소원의 영향을 검토하기 위하여 배양 후 균체의 생육도와 효소활성을 측정한 결과 glucose를 첨가하였을 때 최대의 생육도와 효소활성을 보였으나, 다른 탄소원에서는 효소활성이 거의 없었다(data not shown). 한편 최대의 활성을 보인 glucose의 농도 변화에 따른 효소의 생산성을 검토하기 위하여 Horikoshi I 배지에 0, 0.
- 이후 활성이 서서히 감소하여 5시간까지도 60%이상의 효소활성을 보였다. 효소 활성이 급격히 감소되는 시점인 1시간까지의 반응을 살펴보면, 10 mM CaCl2를 첨가한 효소에서 무첨가군 보다 90%나 증가된 활성을 보여 CaCl2가 열안정성을 빠르게 회복하는 것으로 확인되었다(Fig. 3D).
후속연구
- 본 연구를 통해 정제된 호알칼리성 protease는 동일계열의 효소와 비교하여 유사하거나 고유의 특성을 갖고 있는 것으로 나타났다. 높은 온도에서의 열안정성 및 알칼리 내성은 호알칼리성과 열안정성이 요구되는 식품, 세제 및 관련산업에서의 응용성이 매우 높다고 기대된다.
- 0으로 조정하여 사용하였다. 이를 통해 세제산업 등 알칼리성에서 활성을 나타내는 protease 수요를 충족시키는데 본 효소나 이를 기반으로 추후 개량된 효소를 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.