쥐 섬유육종에서 베타카로틴과 방사선조사 병용의 항종양 효과: 세포독성 및 종양성장 지연에 미치는 영향 Anti-tumor Effect of Combined Betacarotene with X-irradiation in the Mouse Fibrosarcoma : Cytotoxicity and Tumor Growth Delay원문보기
목적 : 베타카로틴과 방사선조사의 병용효과에 관한 평가를 목적으로, 베타카로틴을 병용한 경우 방사선조사 단독의 경우 보다 세포독성의 차이는 어떠하며, 또한 쥐 섬유육종에서 두 군간의 종양성장의 지연 정도에 어떠한 차이가 있는가를 관찰하고자 본 연구를 시행하였다. 대상 및 방법 : 2$\%$ 베타카로틴 유제를 2 mg/ml 으로 만든 다음 단계적으로 희석하여 사용하였으며, 섬유육종세포와 태생 5~6주의 C3H/N의 실험쥐를 이용하였다. 방사선조사는 6 MV선형가속기를 이용하였고, 세포내 독성은 쥐 섬유육종세포의 생존을 감소시키는 능력으로 평가하였으며, 베타카로틴 2 mgfml을 방사선조사 1시간 전 섬유육종세 포주에 접촉시켰다. 종양성장 지연 실험을 위하여 베타카로틴과 방사선조사 병용군(n=6)과 방사선조사 단독군(n=5)으로 분류하였으며, 베타카로틴 20 mg/kg을 방사선조사 30분전 섬유육종이 접종된 쥐의 복강내 일회 주사하였고, 방사선조사량은 20 Gy를 주었다. 종양용적은 장경$\times$장경$\times$장경/(mm$^{3}$) 공식을 사용하였으며, 2$\~$3일 마다 측정하였다. 결과 : 섬유육종세포에 베타카로틴 0.002, 0.02, 0.2, 2 mg/ml 농도액을 1시간 동안 접촉 후 얻은 각각 생존분율은 0.69$\pm$0.07, 0.59$\pm$0.08, 0.08$\pm$0.008 및 0.02$\pm$0.006이었다. 그리고 방사선조사 1시간 전 섬유육종세포에 베타카로틴 2mg/ml을 접촉한 후 조사량 2, 4, 6 및 8 Gy에서 얻은 각각의 생존분율은 0.13$\pm$0.05, 0.03$\pm$0.005, 0.01$\pm$0.002 및 0.009$\pm$0.0008이었으며 방사선조사 단독군의 경우 동일 조사량에서 얻은 생존분율은 각각 0.66$\pm$0.05, 0.40$\pm$0.04, 0.11$\pm$0.01 및 0.03$\pm$0.006으로 나타났다(P<0.05). 종양성장의 지연정도를 나타내는 실험에서 섬유육종을 쥐에 접종한 후 종양의 용적이 1,000 mm$^{}$ 에 달하는 기간은 베타카로틴 병용군과 방사선조사 단독군에서 각각 18일과 19일로 나타났다(p>0.05). 결론 :쥐 섬유육종세포에 베타카로틴을 접촉한 경우 세포독성이 나타났으며, 베타카로틴 농도 증가에 따라 세포 독성도 증가하였다. 그리고 쥐 섬유육종세포의 세포독성은 베타카로틴 병용군에서 방사선조사 단독군의 경우 보다 부가적으로 증가하였으며, 두 군간에 통계학적으로 현저한 차이를 보였다. 그러나 쥐 섬유육종 성장 지연정도에 있어서 베타카로틴 병용군과 방사선조사 단독군간의 통계학적으로 뚜렷한 차이는 없었다.
목적 : 베타카로틴과 방사선조사의 병용효과에 관한 평가를 목적으로, 베타카로틴을 병용한 경우 방사선조사 단독의 경우 보다 세포독성의 차이는 어떠하며, 또한 쥐 섬유육종에서 두 군간의 종양성장의 지연 정도에 어떠한 차이가 있는가를 관찰하고자 본 연구를 시행하였다. 대상 및 방법 : 2$\%$ 베타카로틴 유제를 2 mg/ml 으로 만든 다음 단계적으로 희석하여 사용하였으며, 섬유육종세포와 태생 5~6주의 C3H/N의 실험쥐를 이용하였다. 방사선조사는 6 MV 선형가속기를 이용하였고, 세포내 독성은 쥐 섬유육종세포의 생존을 감소시키는 능력으로 평가하였으며, 베타카로틴 2 mgfml을 방사선조사 1시간 전 섬유육종세 포주에 접촉시켰다. 종양성장 지연 실험을 위하여 베타카로틴과 방사선조사 병용군(n=6)과 방사선조사 단독군(n=5)으로 분류하였으며, 베타카로틴 20 mg/kg을 방사선조사 30분전 섬유육종이 접종된 쥐의 복강내 일회 주사하였고, 방사선조사량은 20 Gy를 주었다. 종양용적은 장경$\times$장경$\times$장경/(mm$^{3}$) 공식을 사용하였으며, 2$\~$3일 마다 측정하였다. 결과 : 섬유육종세포에 베타카로틴 0.002, 0.02, 0.2, 2 mg/ml 농도액을 1시간 동안 접촉 후 얻은 각각 생존분율은 0.69$\pm$0.07, 0.59$\pm$0.08, 0.08$\pm$0.008 및 0.02$\pm$0.006이었다. 그리고 방사선조사 1시간 전 섬유육종세포에 베타카로틴 2mg/ml을 접촉한 후 조사량 2, 4, 6 및 8 Gy에서 얻은 각각의 생존분율은 0.13$\pm$0.05, 0.03$\pm$0.005, 0.01$\pm$0.002 및 0.009$\pm$0.0008이었으며 방사선조사 단독군의 경우 동일 조사량에서 얻은 생존분율은 각각 0.66$\pm$0.05, 0.40$\pm$0.04, 0.11$\pm$0.01 및 0.03$\pm$0.006으로 나타났다(P<0.05). 종양성장의 지연정도를 나타내는 실험에서 섬유육종을 쥐에 접종한 후 종양의 용적이 1,000 mm$^{}$ 에 달하는 기간은 베타카로틴 병용군과 방사선조사 단독군에서 각각 18일과 19일로 나타났다(p>0.05). 결론 :쥐 섬유육종세포에 베타카로틴을 접촉한 경우 세포독성이 나타났으며, 베타카로틴 농도 증가에 따라 세포 독성도 증가하였다. 그리고 쥐 섬유육종세포의 세포독성은 베타카로틴 병용군에서 방사선조사 단독군의 경우 보다 부가적으로 증가하였으며, 두 군간에 통계학적으로 현저한 차이를 보였다. 그러나 쥐 섬유육종 성장 지연정도에 있어서 베타카로틴 병용군과 방사선조사 단독군간의 통계학적으로 뚜렷한 차이는 없었다.
Purpose :To investigate whether combined beta-carotene with X-Irradiation has more enhanced radition response than X-irradiation or not, we peformed a experiment about in vitro cytotoxlcity of beta-carotene and/or X-irradiation in the fibrosarcoma cells, tumor growth delay of combined beta-caroten w...
Purpose :To investigate whether combined beta-carotene with X-Irradiation has more enhanced radition response than X-irradiation or not, we peformed a experiment about in vitro cytotoxlcity of beta-carotene and/or X-irradiation in the fibrosarcoma cells, tumor growth delay of combined beta-caroten with/or X-irradiation in the mouse fibrosarcoma. Materials and Methods : 2$\%$ emulsion of beta-carotene was serially diluted and used. X-Irradiation was given by 6 MeV linear accelerator. The cytotoxicity of beta-carotene in vitro was evaluated from clonogenic assay. To compare the cytotoxiclty between combined beta-carotene with X-irradiation and X-irradiation group, 2 mg/ml of beta-carotene was contacted to fibrosarcoma (FSall) cells for 1 hour before X-irradiation. For the tumor growth delay, single 20 Gy was given to FSall tumor hearing C3H/N mice whic was classified as beta-crotene with X-irradiation group (n=5) and X-irradiation alone group (n=5). 0.2 ml of 20 mg/kg of beta-carotene were i.p. injected to mice 30 minute before X-irradiation in the beta-crotene with X-irradiation group. The tumor growth delay defined as the time which reach to 1,000 mm$^{3}$ of tumor volume. Results : (1) Cytotoxicity in vitro: 1) survival fraction at beta-carotene concentration of 0.002,0.02,0.2 and 2 mg/ml were 0.69$\pm$0.07, 0.59$\pm$0.08, 0.08$\pm$0.008 and 0.02$\pm$0.006, respectively. 2) each survival fraction at 2, 4, 6 and 8 Gy in the 2 mg/ml of beta-carotene + X-irradiation group were 0.13$\pm$0.05, 0.03$\pm$0.005, 0.01 $\pm$0.002 and 0.009$\pm$0.0008, respectively. But each survival fraction at same irradiation dose in the X-irradiation group were 0.66$\pm$0.05, 0.40$\pm$0.04, 0.11$\pm$0.01 and 0.03$\pm$0.006, respectively(p<0.05). (2) The time which reach to 1,000 mm$^{3}$ of tumor volume of beta-carotene + X-irradiation group and X-irradiation alone group were 18, 19 days, respectively(p>0.05) Conclusion : The contact of beta-caroten to Fsall cells showed mild cytotoxicity which 띤as increased according to concentration. The cytotoxicity of combined beta-carotene with X-irradiation more increased than that of X-irradiation, additionally, And there was significant difference of cytotoxicity between two groups. But there were no significant difference of the growth delay of fibrosarcoma between two groups.
Purpose :To investigate whether combined beta-carotene with X-Irradiation has more enhanced radition response than X-irradiation or not, we peformed a experiment about in vitro cytotoxlcity of beta-carotene and/or X-irradiation in the fibrosarcoma cells, tumor growth delay of combined beta-caroten with/or X-irradiation in the mouse fibrosarcoma. Materials and Methods : 2$\%$ emulsion of beta-carotene was serially diluted and used. X-Irradiation was given by 6 MeV linear accelerator. The cytotoxicity of beta-carotene in vitro was evaluated from clonogenic assay. To compare the cytotoxiclty between combined beta-carotene with X-irradiation and X-irradiation group, 2 mg/ml of beta-carotene was contacted to fibrosarcoma (FSall) cells for 1 hour before X-irradiation. For the tumor growth delay, single 20 Gy was given to FSall tumor hearing C3H/N mice whic was classified as beta-crotene with X-irradiation group (n=5) and X-irradiation alone group (n=5). 0.2 ml of 20 mg/kg of beta-carotene were i.p. injected to mice 30 minute before X-irradiation in the beta-crotene with X-irradiation group. The tumor growth delay defined as the time which reach to 1,000 mm$^{3}$ of tumor volume. Results : (1) Cytotoxicity in vitro: 1) survival fraction at beta-carotene concentration of 0.002,0.02,0.2 and 2 mg/ml were 0.69$\pm$0.07, 0.59$\pm$0.08, 0.08$\pm$0.008 and 0.02$\pm$0.006, respectively. 2) each survival fraction at 2, 4, 6 and 8 Gy in the 2 mg/ml of beta-carotene + X-irradiation group were 0.13$\pm$0.05, 0.03$\pm$0.005, 0.01 $\pm$0.002 and 0.009$\pm$0.0008, respectively. But each survival fraction at same irradiation dose in the X-irradiation group were 0.66$\pm$0.05, 0.40$\pm$0.04, 0.11$\pm$0.01 and 0.03$\pm$0.006, respectively(p<0.05). (2) The time which reach to 1,000 mm$^{3}$ of tumor volume of beta-carotene + X-irradiation group and X-irradiation alone group were 18, 19 days, respectively(p>0.05) Conclusion : The contact of beta-caroten to Fsall cells showed mild cytotoxicity which 띤as increased according to concentration. The cytotoxicity of combined beta-carotene with X-irradiation more increased than that of X-irradiation, additionally, And there was significant difference of cytotoxicity between two groups. But there were no significant difference of the growth delay of fibrosarcoma between two groups.
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문제 정의
본 연구는 베타카로틴을 방사선조사에 병용한 경우 쥐 섬유육종세포의 세포독성과 섬유육종의 성장 지연에 미치는 영향을 알아보고자 시도하였다.
제안 방법
assay법을 이용하였다. 200~2,000개의 쥐 섬유육종세포를 10% 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지액에 24~36시간 정도 배양하여 지수성장에 도달하게 한 다음, 0.002, 0.02, 0.2 및 2 mg/ml의 베타카로틴 시료를 각각 배양플라스크의 바닥에서자라고 있는 섬유육종세포주에 1시간 동안 접촉시켰다. 이후 RPMI 1640 배지로 세척하여 일주일 정도 세포배양기(37C, 5% CO2)에서 배양하였으며, 생성된 콜로니를 알코올로 고정한 뒤 crystal violet 으로 염색하여 콜로니 수를 계산하였다.
암 세포주는 생명공학 연구소(대덕, 대전)에서 분양받은 태생 5~6주의 C3H/N 쥐를 통해 얻은 섬유육종세포 (FSaH)를 사용하였다. X-선 조사는 6 MV 에너지의 선형가속기(Siemens Co., Germany)를 사용하였으며, 방사선 발생원부터 100cm 거리에 배양플라스크 또는 실험쥐 조사를 위하여 제작한 원형의 아크릴 상자를 놓고 조사하였다. 사용된 방사선조사량은 2, 4, 6, 8 Gy이었다.
종양용적은 방사선조사 후 2~3일 마다 공구제도용 자를 이용하여 단경과 장경을 측정한 다음 장경X장경X장경/2 (mm3) 공식을 사용하여 구하였다. 그리고 두 군간의 종양 성장의 지연정도를 비교하기 위하여 종양세포 접종 후 1,000 mm3에 달하는 기간을 사용하였다. 그리고 두 군간의 세포독성과 종양성장 지연의 차이에 관한 통계학적 검정은 t-test를 사용하였다.
이후 RPMI 1640 배지로 세척하여 일주일 정도 세포배양기(37C, 5% CO2)에서 배양하였으며, 생성된 콜로니를 알코올로 고정한 뒤 crystal violet 으로 염색하여 콜로니 수를 계산하였다. 그리고 이를 토대로 베타카로틴의 농도에 따른 생존분율을구하였다. 또한 베타카로틴 및 방사선조사 병용군과 방사선조사 단독군 사이의 세포독성 정도를 비교하기 위하여 clonogenic assay법을 이용하였다.
연구자들이 복강내 주사 방식을 택한 이유는 사실상 국내에서 원하는 용량의 베타카로틴이 함유된 실험쥐 먹이를 제조하는 것이 어려웠기 때문이었다. 따라서 연구자들은 이를 대체하기 위하여 베타카로틴 2 mg/ml을 실험쥐의 체중으로 환산하여 20 ㎎/㎏ 농도액을 산출한 후 이를 복강내 조사하였다. 연구자들의 종양지연 실험 결과에서 베타카로틴 병용 군이 방사선조사 단독군 보다 차이를 나타내지 못한 이유가 이러한 베타카로틴의 투여 경로 또는 용량 문제인가는 앞으로 규명할 문제라고 본다.
베타카로틴 및 방사선과 병용군과 방사선조사 단독군 사이에 실험쥐 섬유육종의 성장크기에 미치는 영향을 비교하기 위한 종양성장 지연 실험을 위하여 베타카로틴 및 방사선조사 병용군(n=6)과 방사선조사 단독군(n=5)으로 분류하였다 C3H/N 쥐에서 섬유육종을 유도하기 위하여 2X105개의 섬유육종세포를 우측 허벅지에 피하 접종하였으며, 약 11일째 종양의 직경이 8-10 mm 정도에 이르러 종양 용적의 측정이 가능하였다. 베타카로틴 병용군의 경우 20 ㎎/㎏ 농도의 베타카로틴 0.
연구자들은 Seifter 등12)과 달리 베타카로틴의 시험관내 세 포독성 연구를 시도하였으며, 이 결과에서 천연 베타카로틴 2 mg/ml 농도를 실험쥐 섬유육종세포에 1시간 동안 접촉하여 0Q2의 생존분율을 얻었다. 다시말해서 동일 농도의 베타카로틴이 약 98%의 섬유육종세포에 손상을 준 셈이다.
2 및 2 mg/ml의 베타카로틴 시료를 각각 배양플라스크의 바닥에서자라고 있는 섬유육종세포주에 1시간 동안 접촉시켰다. 이후 RPMI 1640 배지로 세척하여 일주일 정도 세포배양기(37C, 5% CO2)에서 배양하였으며, 생성된 콜로니를 알코올로 고정한 뒤 crystal violet 으로 염색하여 콜로니 수를 계산하였다. 그리고 이를 토대로 베타카로틴의 농도에 따른 생존분율을구하였다.
2 ml를 방사선조사 30분전, 직경이 8-10 mm정도에 이른 C3H/N 쥐에 복강내 일회 주사하였으며, 두 군의 C3H/N 쥐에 각각 주어진 방사선조사량은 20 Gy이었다. 종양용적은 방사선조사 후 2~3일 마다 공구제도용 자를 이용하여 단경과 장경을 측정한 다음 장경X장경X장경/2 (mm3) 공식을 사용하여 구하였다. 그리고 두 군간의 종양 성장의 지연정도를 비교하기 위하여 종양세포 접종 후 1,000 mm3에 달하는 기간을 사용하였다.
한 배양플라스크의 쥐 섬유육종세포에 1시간 접촉시킨 다음, 동일한 방사선조사량을 조사하고 상기와 같은 방법으로 각각 생존분율을 구하였다 세포독성 실험은 3회 반복하였다
대상 데이터
, Germany)를 사용하였으며, 방사선 발생원부터 100cm 거리에 배양플라스크 또는 실험쥐 조사를 위하여 제작한 원형의 아크릴 상자를 놓고 조사하였다. 사용된 방사선조사량은 2, 4, 6, 8 Gy이었다.
002 mg/ml의 농도를 얻어 시료로 사용하였다. 암 세포주는 생명공학 연구소(대덕, 대전)에서 분양받은 태생 5~6주의 C3H/N 쥐를 통해 얻은 섬유육종세포 (FSaH)를 사용하였다. X-선 조사는 6 MV 에너지의 선형가속기(Siemens Co.
천연산 베타카로틴(Betatene Ltd., Australia) 2% 유제를 RPMI 1640 배지액과 혼합하여 2 mg/ml를 만든 후 이를 희석하여 각각 0.2, 0.02, 0.002 mg/ml의 농도를 얻어 시료로 사용하였다. 암 세포주는 생명공학 연구소(대덕, 대전)에서 분양받은 태생 5~6주의 C3H/N 쥐를 통해 얻은 섬유육종세포 (FSaH)를 사용하였다.
데이터처리
그리고 두 군간의 종양 성장의 지연정도를 비교하기 위하여 종양세포 접종 후 1,000 mm3에 달하는 기간을 사용하였다. 그리고 두 군간의 세포독성과 종양성장 지연의 차이에 관한 통계학적 검정은 t-test를 사용하였다.
이론/모형
그리고 이를 토대로 베타카로틴의 농도에 따른 생존분율을구하였다. 또한 베타카로틴 및 방사선조사 병용군과 방사선조사 단독군 사이의 세포독성 정도를 비교하기 위하여 clonogenic assay법을 이용하였다. 방사선조사 단독군의 경우 쥐 섬유육종세포에 2, 4, 6, 8 Gy를 조사하였고, 병용군의 경우 베타카로틴 2 mg/ml 농도 2 ml를 RPMI 1640 배지액을 함유z
베타카로틴의 세포독성 정도를 알아보기 위하여 clonogenic assay법을 이용하였다. 200~2,000개의 쥐 섬유육종세포를 10% 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지액에 24~36시간 정도 배양하여 지수성장에 도달하게 한 다음, 0.
성능/효과
이러한 결과는 베타카로틴이 방사선조사에 세포보호 작용이 있다고 알려진 점으로 보아 매우 생소하며, 이의 규명을 위한 실험연구가 더욱 필요하다고 본다. 그리고 섬유육종세포에 베타카로틴 2 mg/ml 농도 2 ml를 1시간 동안 접촉시킨 후 얻은 세포독성은 2~8 Gy의 방사선조사량 전 범위에서 베타카로틴 및 방사선조사 병용군이 방사선조사 단독군 보다 약 10배 정도 균등하게 증가된 점으로 보아 베타카로틴의 병용효과가 방사선조사의 세포독성을 직접 증가시켰거나 감소시키지는 않았으며 단순히 베타카로틴의 세포독성 효과와 방사선조사의 세포독성이 부가적으로 작용하여 방사선조사단독군 보다 세포독성이 증가한 것으로 추정된다. 그러나 C3H/N 실험쥐실험쥐에 섬유육종세포를 접종하여 종양을 이용한 성장지연의 실험에서 방사선조사 직전 천연베타카로틴 20 ㎎/㎏ 농도 0.
쥐 섬유육종세포를 접종한 후 종양의 용적이 1,000 mm3에 달하는 기간은 베타카로틴 및 방사선조사 병용군과 방사선조사 단독군에서 각각 19일과 18일로 나타났다0>0.05) (Fig. 3).
쥐 섬유육종세포에 베타카로틴 0.002, 0.02, 0.2, 2 mg/ml 농도액을 1시간 동안 접촉시킨 후 얻은 생존분율은 각각 0.69+0.07, 0.59 ±0.08, 0.08 +0.008 및 0.02 ±0.006으로 나타났다(Fig. 1).
쥐 섬유육종세포에 베타카로틴 2 mg/ml 농도 2 ml를 1시간 동안 접촉시킨 다음, 병용 목적으로 방사선조사량 2, 4, 6, 8 Gy를 주었을 때 얻은 생존분율은 각각 0.13 ±0.05, 0.03 ± 0.005, 0.01 ±0.002, 0.009 ±0.0008 이었으며, 방사선조사 단독군의 경우 동일조사량에서 얻은 생존분율은 각각 0.66±0.05, 0.40±0.04, 0.11 ±0.01 및 0.03±0.006으로 나타났다(p<0.05) (Fig. 2).
후속연구
다시말해서 동일 농도의 베타카로틴이 약 98%의 섬유육종세포에 손상을 준 셈이다. 이러한 결과는 베타카로틴이 방사선조사에 세포보호 작용이 있다고 알려진 점으로 보아 매우 생소하며, 이의 규명을 위한 실험연구가 더욱 필요하다고 본다. 그리고 섬유육종세포에 베타카로틴 2 mg/ml 농도 2 ml를 1시간 동안 접촉시킨 후 얻은 세포독성은 2~8 Gy의 방사선조사량 전 범위에서 베타카로틴 및 방사선조사 병용군이 방사선조사 단독군 보다 약 10배 정도 균등하게 증가된 점으로 보아 베타카로틴의 병용효과가 방사선조사의 세포독성을 직접 증가시켰거나 감소시키지는 않았으며 단순히 베타카로틴의 세포독성 효과와 방사선조사의 세포독성이 부가적으로 작용하여 방사선조사단독군 보다 세포독성이 증가한 것으로 추정된다.
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