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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 농촌진흥청에서 개발한 베타카로틴강화미에 사용된 발현단백질에 대해 알레르기 유발성을 평가하기 위해 아나필락시스시험을 수행하였다.
제안 방법
- 1주간 순화기간을 거친 300 ±50 g의 Hafley계 수컷 기니픽을 피내투여 24시간 전 제모기를 사용하여 등 부위를 가능한 넓게 제모하였으며, 주사부위를 marker로 표시한 다음 대조군과 각 시험군의 항혈청 50 씩을 표시부위에 피내주사 하였다.
- 300 ±50 g의 Hartley계 수컷 기니픽에 각 시험군 및 음성대조군(Saline)은 일주일에 3회 씩 총 9회 피하 투여하였고, 양성대조군은 Ovalbumin과 FCA(Freund's complete adjuvant) 와 FIA(Freund's incomplete adjuvant)를 사용하여 일주일에 1회씩 총 3회 감작하였다. 최종 투여 2주일 후에 기니픽의 복대 정맥에서 혈액을 채취하였으며, 4℃에서 3, 500 rpm, 15분 동안 원심분리후 상층액을 분리해 항혈청을 제조하였다.
- 4종의 발현단백질의 투여농도를 계산하였다. 4종의 단백 질을 발현비율로 혼합하여 혼합투여물질을 조제하였으며 , 시험시료는 투여직전 멸균 증류수에 용해하여 사용하였고, 대조군으로는 멸균 증류수를 사용하였다 .
- 각 단백질의 투여농도는 각각이 베타카로틴강화 현미에서 발현되는 양을 기준으로 임상농도(Low)를 계산하였으며, 공비를 10배로 하여 고농도(High)를 설정하였다. 각각 단백질 당 투여농도는 2A(Low): 0.
- 10배로 하여 고농도(High)를 설정하였다. 각각 단백질 당 투여농도는 2A(Low): 0.2 100 g, 2A(High): 2100 g, PAT(Low): 10 yelOO g, PAT(High): 1001@100 g, QrI(Low): 4.45 100 g, CtrI(High) : 44.5 100 g, PSY(Low) 45.4 100 g, PSY(High): 454 nelOO g으로 하였다. 4종 단백질 혼합투여물질은 Mix.
- 따라서, 실험동물로는 기니픽을 선발하였으며, 300 ±50 g의 Hartley계 수컷 기니픽을 (주)한림실험동물연구소에서 제공받아 일주일의 순화기간을 거친 후 건강한 동물만을 선별하여각 시험물질 당 5마리씩 사용하였다. 사육환경은 온도 23 士 2℃, 습도 55 ±5% 배기 10-15/hr, 조명 12시간 및 조도 200-300 L&이었고, 기니픽 사료는 기니픽용 고형사료(LabDiet 5025) 를 음용수는 멸균수를 자유롭게 공급하였다.
- 수동피부아나필락시스 반응시험 (PCA, Passive Cutaneous Anaphylaxis test)은 동종(기니픽-기니픽)피부 아나필락시스 반응시험을 수행하였다.
- 시험에 사용된 각 발현단백질은 현미 배유에서 발현되는 양을 기준으로 하였으며, 성인 1 인당 쌀 섭취량을 최대 500 g로 하여 4종의 발현단백질의 투여농도를 계산하였다. 4종의 단백 질을 발현비율로 혼합하여 혼합투여물질을 조제하였으며 , 시험시료는 투여직전 멸균 증류수에 용해하여 사용하였고, 대조군으로는 멸균 증류수를 사용하였다 .
- 아나필락시스쇼크 반응시험 (ASA, Active Systemic Anaphylaxis test)에서는 300 ±50 g의 HaMey계 수컷 기니픽에 각 시험 군 및 음성대조군(Saline)은 일주일에 3회 씩 총 9회 피하 투여하였고, 양성대조군은 Ovalbumin과 FCA(Freund5s complete adjuvant)와 FIA(Freund's incomplete adjuvant)를 사용하여 일주일에 1 회씩 총 3회 감작하였다. 최종감작 2주일 후 각각의 투여용량 중 고용량의 항원을 정맥주사하고, 60분 동안 반응을 관찰하였다(식품의약품안전청 , 1999).
- 채혈 한 혈액을 혈액분석기(Baker system 9118 Hematology Analyzer. Biochem Immunosystems Inc., U.S.)을 사용흐p 여 총백혈구함량을 측정하였다.
- 1회씩 총 3회 감작하였다. 최종 투여 2주일 후에 기니픽의 복대 정맥에서 혈액을 채취하였으며, 4℃에서 3, 500 rpm, 15분 동안 원심분리후 상층액을 분리해 항혈청을 제조하였다.
- 일주일에 1 회씩 총 3회 감작하였다. 최종감작 2주일 후 각각의 투여용량 중 고용량의 항원을 정맥주사하고, 60분 동안 반응을 관찰하였다(식품의약품안전청 , 1999).
- 보정하였다. 항혈청 피내주사 24시간 후 야기항원과 2% Evans blue를 동량으로 혼합하여 기니픽의 미정맥에 주사하였고, 30분 경과 후 항혈청 주사부위에 나타나는 청색반점을 관찰하였다(식품의약품안전청, 1999).
- 항혈청은 2°-2'°배 희석하여 사용하였고, 한 개체의 항혈청을 2-3마리씩 피내주사하여 개체군간의 차이를 보정하였다. 항혈청 피내주사 24시간 후 야기항원과 2% Evans blue를 동량으로 혼합하여 기니픽의 미정맥에 주사하였고, 30분 경과 후 항혈청 주사부위에 나타나는 청색반점을 관찰하였다(식품의약품안전청, 1999).
대상 데이터
- 2010). 따라서, 실험동물로는 기니픽을 선발하였으며, 300 ±50 g의 Hartley계 수컷 기니픽을 (주)한림실험동물연구소에서 제공받아 일주일의 순화기간을 거친 후 건강한 동물만을 선별하여각 시험물질 당 5마리씩 사용하였다. 사육환경은 온도 23 士 2℃, 습도 55 ±5% 배기 10-15/hr, 조명 12시간 및 조도 200-300 L&이었고, 기니픽 사료는 기니픽용 고형사료(LabDiet 5025) 를 음용수는 멸균수를 자유롭게 공급하였다.
- 본 시험에 사용한 시험물질 2A(amono acid, Mw: 220 Da, 순도: 95%이상), PAT(phosphinotricin Acetyl-transferase, Mw: 20 KDa, 순도: 85%), CtrI(Carotene desaturase, Mw: 53 kDa, 순도: 82%), PSY(phytoene synthase, Mw: 46 kDa, 순도: 76%)는 농촌진흥청 국립농업과학원 생물안전성부에서제공받아 사용하다.
성능/효과
- 4종의 발현단백질을 항원으로 감작시켜 얻은 기니픽 항혈청을 정맥내에 주사하여 IgE 역가를 알아본 결과, Ovalbumin 군 2, (2마리) 22마리) 1마리), PAT-High 2%1마리), 27(4 마리), 2A-High 2(1마리), 22마리), 2마리), PSY-High 2%마리), &2마리), 21마리), 1마리), 혼합-Hi1 22(1 마리), 2〔3마리), 마리)에서 양성반응을 나타냈다.
- 각 군별 총 백혈구함량을 측정한 결과, PAT- High에서 총 백혈구 함량은 유의성있는 차이를 나타냈으나(P< 0.001), 다른 투여단백질 간에는 큰 차이를 나타내지 않았다(Table 1).
- 감작기간 동안 각 군당 기니픽의 체중변화를 살펴본 결과투여군 간에 유의적 차이는 없었고, 이상독성증상 또한 관찰되지 않았다.
- 또한 PAT에 대한 피부 단자시험과 ELISA에서 혈청 내 PAT-특이 IgE의 존재를 증명하지 못하였다(Batista 등, 2005; Tagagi 등, 2006)고 하였다. 그러나, 본 시험에서는 백혈구수 증가와 아낙필락시스반응및 IgE역가가 높이 측정되었으며, 위의 연구들과 상반되는 결과를 나타냈다.
- 따라서, Ctrl를 제외한 베타카로틴발현단백질 3종 고농도와 베 타카로틴강화미 발현단백질 4종을 혼합하여 고농도로 투여 시 일부 개체에서 아낙필락시스반응을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
- 국소 아나필락시스반응은 피부' 비후막, 위장관막 등에서 국소적인 항원에 의한 급성염증을 일으킨다(Jo 드 2003; Park과 Bae, 2008). 따라서, 본 연구 결과로 베타카로틴강화미 발현단백질 중 PAT고농도 투여가 IgE 항체에의한 과민성쇼크 유발 가능성을 유추할 수 있다.
- 베타카로틴 섭취 시 나타날 수 있는 반응은 개별적인 차이가 있을 수 있으나, 본 시험은 섭취기준보다 상한 범위인 성인 500 g/day을 베타카로틴 현미 100%(Low)로 섭취하였을 경우와 이의 10배 섭취(High)를 기준으로 시험되었고, 고농도로 설정된 시험군과는 달리 저농도로 설정된 각 발현단백질 4종에서 백혈구수 증가 및 아나필락시스 반응 등이 음성반응으로 나타나, 500 g/day 이하로 섭취한다면 알레르기 등의 면역반응에 크게 영향을 주진 않을 것으로 사료된다.
- 아나필락시스쇼크유발시험 결과, Ovalbumin군은 항원 정맥투여 후 심한 경련반응을 나타내다가 5마리 모두 사망하였으며, PAT-High 2마리에서 코를 문지르는 증상을 보였고, 3 마리에서는 찍찍거리는 소리를 내어 경미한 또는 중등 정도의 아나필락시스 반응을 나타냈으나 사망개체는 없었다. 그 외다른 투여군에서는 양성반응이 관찰되지 않았다(Table 2).
- 혼합-Low에서(1마리), 2마리)가 경미한 양성반응을 보였으며, Ctrl-Low과 2A-Low 및 PSY-Low에서는 양성반응을 보이지 않아 IgE 역가가 '0, 으로 IgE를 생성하지 않는 것으로 판단되었다(Table 3).
후속연구
- 따라서, 섭취에 대한 지속적인 모니터링을 실시 및 하루 섭취 기준량 설정, 그리고 다양한 체액성 면역반응 실험 등 베타카로틴강화미 알레르기 유발 가능성 연구가 필요하다고 판단된다.
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