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제안 방법
- 5. 2.0, 2, 5, 3 0% 첨가하여 각 탄소원의 효괴를 조사하몄다. 일반적 £로 亙모 배양시 탄소원으쿠써 glucose가 많-이 사용되는데 본 실험에 사용한 제조합 효모도 Fig.
- Defensin을 발현하거나 세포 외로 분비히는데 관련된 효소들, 그리고 host의 최적 배양온도에 띠라 활성이 달라질 수 있으므로 위에 결정한 최적 배지조성과 초기 pH에서 최적 배양온도를 결 정하였다. Fig 8의 그림에서 로듯이 대략 24~3俨C, 사이에서 세 포성장콰 힝균활성이 좋았고 28旳의 배양온도에서 세포성장과 항균활성이 가장 좋았으며 30℃ 이후로는 급격하게 감소되었다.
- 0% agar )를 시용하였다. De炀sin 생신을 높이기 위한 최직 배 양조건 중 베지에서는 YTD를 기본으로 하고 여기에 유기 질소 원, 탄소원, 무기염류 등의 영양소 성분을 농도별로 첨가하여 효과를 조사하였다. 재조합 효모세포는 150 ipm, 에서 4$시간 진탕배양한 후 항균활성을 측정하였다.
- 8. cerevisiae MFM 유전지를 힘유 한 재조합 plasmid Yep70aT>(9) 以庆a厶의 preproscquence 원으 로, 대징균과 효모의 shuttle vector이고 S cerevzs旭e의 G, 丑‘7(14) 유전자를 함유한 plasmid pAA7을 defcnsm 분비 vector 제조의 기본 골격으로 시옹■하였다.
- 따라서 본 연구에서는 효모 5. cerevisiaee, 분비계를 이용하어 쉬파리에서 유 래된 defensine 항균활성이 있는 활성 혐의 재조합 defensin 생산 계를 구축하고 재조합 효모로부터 defensin의 생산성을 높이기 위한배지 및 비양조건의 최적화를 시도하였다.
- 대징균의 배양을 위해서는 LB 배지 (1% Bacto-tryptone. 0 5% Bacto-yeast extract, 1% NaCl) 를 사용히였으며 효모의 배양을 위한 복합배지로는 YPD 배지 (]% Bacto-yeast extract, 2% Bacto-peptone. 2% glucose)를 사욤하였다. 효모 형질전환체의 I 차 선별을 위한 최소배지로 YMBD 배지 (0 67% Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, 2.
- 세루이 제작한 플리스미드의 증폭을 위해 E coii DH5a {supE44 ^/lacUl69 (^8Q!acZeM15) hsdRI7 s-ecAl endAl g)>rA96 thi-1 relAl)를 사용하였다 pBIueScript KS (+) 벡터는 합성한 defensin 유전자의 임기서열을 확인하는데 현시키는 깃이 불가능할 것으로 생직-되어, 段政의 prcpro- sequence를 이용하여 발현된 항균펩티드가 단백질 뿐해효소 YscF (KEX2 gene product)메 (13) 의해 기-수분해되어 활성적인 형태의 힝균펩티드가 세포외로 분비되게 시도하였다 羽의 preprosequence는 PCR로 증폭한후 5, 고'卜 3' primer에 힘유된 제한 효소 인식부위에 헤당하는 ReRJ과 Xb试을 처리한 후 agarose 幽에서 분리하고. 분리한 DNA 단편을 pUCI9에 subdoning하여 염기서열을 분석하였다. 이미 보고된 유전지-의 염기서열 (1)을 토대로 defensin의 유전자를 세 부위로 니누어 효모의 preferable cod®으로 대체하여 oligom러를 합성하였다.
- cerevisuie 2805 (a, i<ra3-52 pep牛:HIS3 eprbl / his3 c曲/)을 사용하였다. 세루이 제작한 플리스미드의 증폭을 위해 E coii DH5a {supE44 ^/lacUl69 (^8Q!acZeM15) hsdRI7 s-ecAl endAl g)>rA96 thi-1 relAl)를 사용하였다 pBIueScript KS (+) 벡터는 합성한 defensin 유전자의 임기서열을 확인하는데 현시키는 깃이 불가능할 것으로 생직-되어, 段政의 prcpro- sequence를 이용하여 발현된 항균펩티드가 단백질 뿐해효소 YscF (KEX2 gene product)메 (13) 의해 기-수분해되어 활성적인 형태의 힝균펩티드가 세포외로 분비되게 시도하였다 羽의 preprosequence는 PCR로 증폭한후 5, 고'卜 3' primer에 힘유된 제한 효소 인식부위에 헤당하는 ReRJ과 Xb试을 처리한 후 agarose 幽에서 분리하고. 분리한 DNA 단편을 pUCI9에 subdoning하여 염기서열을 분석하였다.
- 여러;升지 유기질소원이 세포성장과 defensin 생신에 미치는 영향을 조사하기 위하여 최소한 효모가 자랄 수 있는 0.2% yeast extract, 2% glucose의 조성을 가진 배지에 corn steep liquoi:, soytone, casitone, peptone, trypione 등의 유기질소원을 0.5, L0, 1.5, 2 0, 2.5%의 농도로 침가하여 각 영양원의 互과를 조사하몄 다. Fig.
- 이 합성 유전자를 인산화시키고 Euuiealing 한 후 以이 십-입되어 있는 pUC19 백터에 ligation 시켰고 염기서열을 확인하였다. 이 plasmid를 EcoRl과 SaA으로 처리하여 MFal preprosequence와 defensin 유 전자를 함유한 약 360 bp DNA 단편을 분리하고, pBG18에서 GAP p的moler를 분리한 후, 모두를 pAA7 vector에 동시에 hgation헤서 최종적으로 선별한 plasmid를 p* GMD 이라 명멍하였다. 이 plasmid에는 GAP promoter, MFal 분비신호인 preprosequence, defensin 구조 유전자, GAL7 temiinator 등의 유 전자가 치례로 연결되어 있다(Fix 1)-시용되었다.
- 이 합성 유전자를 인산화시키고 Euuiealing 한 후 以이 십-입되어 있는 pUC19 백터에 ligation 시켰고 염기서열을 확인하였다. 이 plasmid를 EcoRl과 SaA으로 처리하여 MFal preprosequence와 defensin 유 전자를 함유한 약 360 bp DNA 단편을 분리하고, pBG18에서 GAP p的moler를 분리한 후, 모두를 pAA7 vector에 동시에 hgation헤서 최종적으로 선별한 plasmid를 pGMD * 이라 명멍하 였다. 이 plasmid에는 GAP promoter, MFal 분비신호인 preprosequence, defensin 구조 유전자, GAL7 temiinator 등의 유 전자가 치례로 연결되어 있다(Fix 1)-
- 이미 보고된 유전지-의 염기서열 (1)을 토대로 defensin의 유전자를 세 부위로 니누어 효모의 preferable cod®으로 대체하여 oligom러를 합성하였다. 이 합성 유전자를 인산화시키고 Euuiealing 한 후 以이 십-입되어 있는 pUC19 백터에 ligation 시켰고 염기서열을 확인하였다. 이 plasmid를 EcoRl과 SaA으로 처리하여 MFal preprosequence와 defensin 유 전자를 함유한 약 360 bp DNA 단편을 분리하고, pBG18에서 GAP p的moler를 분리한 후, 모두를 pAA7 vector에 동시에 hgation헤서 최종적으로 선별한 plasmid를 p* GMD 이라 명멍하였다.
- 분리한 DNA 단편을 pUCI9에 subdoning하여 염기서열을 분석하였다. 이미 보고된 유전지-의 염기서열 (1)을 토대로 defensin의 유전자를 세 부위로 니누어 효모의 preferable cod®으로 대체하여 oligom러를 합성하였다. 이 합성 유전자를 인산화시키고 Euuiealing 한 후 以이 십-입되어 있는 pUC19 백터에 ligation 시켰고 염기서열을 확인하였다.
- 5% glucose, 0 05% CaCO3, 배양초기 pH 3, 그리고 배양온도 28"C의 결과를 얻었다. 일반적으로 효모세포 배양에서 사용되는 YPD 배지와 본 연구에서 결정한 최적 배양조건에 디하여 시간 별로 세포성장과 defensin 생산을 비교하여 Fig. 9에 나타내었다. 그 결과 YPD에 비해 약 2배의 세포성장과 약 4베의 defensin 분비를 확인할 수 있었다.
- De炀sin 생신을 높이기 위한 최직 배 양조건 중 베지에서는 YTD를 기본으로 하고 여기에 유기 질소 원, 탄소원, 무기염류 등의 영양소 성분을 농도별로 첨가하여 효과를 조사하였다. 재조합 효모세포는 150 ipm, 에서 4$시간 진탕배양한 후 항균활성을 측정하였다. M.
- 세포성장은 12시간미다 채취한 배양액을 적당한 배율로 희석 하여 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 정량적으로 항균활성을 측정하기 위해 0.8% top ag히와』星 加/做y가 깔린 플레이트에 well을 만들고 1/2 배씩 연속희석한 배양액 50 니을 loading하고 37Q케서 24시간 배양한 후 well 주위에 투명환이 생기는지 관 찰하여 arbitrary unit (AU)로 환산하였다 (1).
- 최적의 배지조성에서 yeast extract 영힝을 조사하였다. 2% corn sleep liquor, 2.
- 탄소원이 미치는 영향을 조사하기 위히-여 0그% yeast extract, 2% com steep hquor의 조성을 가진 배지에 glycerol, siiciose, fructose, glucose, maltose, ethanol 등의 탄소원을 0.5, 1.0, 1.5. 2.
- 2% glucose)를 사욤하였다. 효모 형질전환체의 I 차 선별을 위한 최소배지로 YMBD 배지 (0 67% Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, 2.0? o dextrose, 0.002% L-His, 2.0% agar )를 시용하였다. De炀sin 생신을 높이기 위한 최직 배 양조건 중 베지에서는 YTD를 기본으로 하고 여기에 유기 질소 원, 탄소원, 무기염류 등의 영양소 성분을 농도별로 첨가하여 효과를 조사하였다.
대상 데이터
- 이 plasmid에는 GAP promoter, MFal 분비신호인 preprosequence, defensin 구조 유전자, GAL7 temiinator 등의 유 전자가 치례로 연결되어 있다(Fix 1)-시용되었다. Micrococcus luteus I AM 1056은 재조합 효모가 분 비히는 dMensm의 힝균력을 측정하기 위한 시험균으로 생몀공학 연구소 유전자은행 (Korean collection for type cultures, KCTC) 에서 분양 받아 사용하였다. 8.
- 본 연구에서는 defensin 유천자의 발현 및 분비를 위한 숙주세 포로서 S. cerevisuie 2805 (a, i<ra3-52 pep牛:HIS3 eprbl / his3 c曲/)을 사용하였다. 세루이 제작한 플리스미드의 증폭을 위해 E coii DH5a {supE44 ^/lacUl69 (^8Q!acZeM15) hsdRI7 s-ecAl endAl g)>rA96 thi-1 relAl)를 사용하였다 pBIueScript KS (+) 벡터는 합성한 defensin 유전자의 임기서열을 확인하는데 현시키는 깃이 불가능할 것으로 생직-되어, 段政의 prcpro- sequence를 이용하여 발현된 항균펩티드가 단백질 뿐해효소 YscF (KEX2 gene product)메 (13) 의해 기-수분해되어 활성적인 형태의 힝균펩티드가 세포외로 분비되게 시도하였다 羽의 preprosequence는 PCR로 증폭한후 5, 고'卜 3' primer에 힘유된 제한 효소 인식부위에 헤당하는 ReRJ과 Xb试을 처리한 후 agarose 幽에서 분리하고.
이론/모형
- 효모에서 defensin의 발현. 분비를 위한 재조합 플라스미드를 숙주인 효모에 도입하기 위해 Dohmen 등 (6)의 방법으로 효모 의 형 질전횐을 수행히-였다. 형질전환체들 중 defcnsin를 세포 외 로 분비하는 균주들을 신별하기 위헤 모든 형질전환체들을 YNBD 한천배지에 looth-pickLLig한 후 30。<2에서 24시간 배양하였다.
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