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문제 정의
- 로인의 기늠성 연구로서 기포성의 식품가공에의 이묨[1이 및 견직물 잔사의 식품소재로서의 응욤[22]에 관한 연구결과도 보고되어 있다. 따라서 본 연구는 실크 피브로인의 생리활성연구의 일환으로서 전보이에 이어 뇌조직의 활성산소 및 그 제거효소에 미치는 실크 피브로인의 영향을 분석하여 유의적인 결과를 얻었기에 보고한다.
제안 방법
- 본 실험에 사용한 사료조성은 전보[8]와 같이 탄수화물57.8% (a -com starch: 44.5% + sucrose 13.3%), 단백질 16.0% (sodium-free casein), 지질 18.0% (lard 18.0%), 비타민과 무기질(AIN-76 mixture) 각각 1.0%, 3.5%, 그리고 섬유질3.0%, DL-methioiune 0.3%, choline chloride 0, 2%를 첨가 하였으며, 여기에 cholesterol 0.5% 및 sodium chloride 0.2%를 첨가하여 고콜레스테롤혈증을 유도하였다. 실험그룹의 사료조성은 실크 피브로인(SFP)를 하루에 각각 2.
- 실크 피보루인(SFP)을 SD계 랫트에 히루 2.5 및 5.0 응/kg BW로써 6주간 투여하여 뇌조직의 활성산소 및 그 재거효소의 활성에 미치는 영향을 분석.평가하였다.
- 2%를 첨가하여 고콜레스테롤혈증을 유도하였다. 실험그룹의 사료조성은 실크 피브로인(SFP)를 하루에 각각 2.5 및 5.0 g/kg BW가 섭취되도록 2.5% 및 5.0%의 SFF를 첨가하는 대신 탄수화물을 각각 2.5% 및 5.0%씩 제외하고 조제하였다.
- 혼합하여 37℃의 항온 수조에서 15분간 가온한 후, 3, 500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이때 carbonyl group외 양은 360 nm와 370 run사이에 있는 흡광도의 파장에서 분자흡광계수(E =22, 000)를 이용하여 계산하였다.
- 한국화학연에서 구입한 Sprague-Dawley계 랫트(male, 160+10 g)를 구입하여 본 대학 돔물 사육실에서 2주동안 예비사육한 다음, 7마리씩 3군으로 나누어 실험용 기본사 료(control group)로써 사육하면서 놈촌진훙청 잠사연구부 에서 할애받은 실크 피브로인(silk fibroin : Mw 50。)을 각각 2.5 및 5.0 g/kg BW가 되도록 사료에 첨가한 실험그룹 (SFP-2.5 및 SFP-5.0 gro叩s)으로 하여 6주간 사육실험을 행하여 뇌조직중의 활성산소의 생성 및 제거효소의 활성에 미치는 실크 피브로인(SFP)의 영향을 평가하있다. 동물사 육실은 항온항습(22±2℃ 65±2% RH)하에서 12시간 싸이클(06:00~18:00)로 명암이 자동 조절된다.
데이터처리
- 본 연구의 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군간의 유의성 검정은 맛udent's t-test[28]3. 실시하였다.
이론/모형
- 0 ml를 첨가, 혼합하여 실온에서 20분간 방치 한 후 분광광도계를 사용, 550 nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 의해 Mn-SOD 및 Cu/Zn-SOD 활성(unit/mg protein)을 측정하였다. 글루타치온 퍼옥시다아제(흠lutathione peroxidase : GSHFx)의 활성은 Laurence 등[18]의 방법에 따라 340 nm에서 NADPH의 감소를 측정하기 위한 방법으로 뇌조직의 cytagl획분에서 측정하몄다.
- 뇌세포의 분획은 저자 등[5]의 방법에 따라 균질 완충용액(1, 15% KCl/ 10 mM phosphate buffer/5 mM EDTA, pH 7.4)을 사용하여 mitochondria, microsomes 및 cytosol 획분을 분획하여 사욤하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowry 등[21]의 방법에 따라 정량하였다.
- 뇌조직중의 과산화지질의 함량은 저자 등[3]이 사용한 방법에 따라 분광광도계를 사용하여 TBA법으로 말론디알데 히드(malondialdehyde : MD시의 함량을 측정하여 과산화지 질(lipid peroxide : LPO)의 함량으로 정량하였다. 뇌획분으로 서 mitochondria와 microsome의 산화단비질 (oxidized protein : OP)의 생성량은 Levine 등[2이의 방법에 따라 carbonyl group(〉C=O)의 생성량을 측정하였다.
- 뇌조직획분의 히드록시 라디칼(OH)의 함량은 deoxy- ribose의 파괴정도에 따라 hydroxyl radical 생성 정도를 측정하는 방법으로서, 뇌조직획분의 산소대사산물에 의해 deoxy- ribose가 파괴되어 aldehyde가 생성되며, 이 aldehyde는 산성 욤액 에서 thiobarbituric acid와 반응하여 발색되는 것을 이용한 Halliwen 등[14]의 방법에 따라 측정하였다. 뇌조직 획분중의 수퍼옥시드 라디칼(superoxide radical : O2)의 생성량은 McCord 등[2이과 Chan 등[1]의 방법에 따라 superoxide dismutase틀 억제할 수 있는 ferricytochrome C의 환원속도를 측정하있다.
- 뇌조직중의 과산화지질의 함량은 저자 등[3]이 사용한 방법에 따라 분광광도계를 사용하여 TBA법으로 말론디알데 히드(malondialdehyde : MD시의 함량을 측정하여 과산화지 질(lipid peroxide : LPO)의 함량으로 정량하였다. 뇌획분으로 서 mitochondria와 microsome의 산화단비질 (oxidized protein : OP)의 생성량은 Levine 등[2이의 방법에 따라 carbonyl group(〉C=O)의 생성량을 측정하였다. 0.
- 4)을 사용하여 mitochondria, microsomes 및 cytosol 획분을 분획하여 사욤하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowry 등[21]의 방법에 따라 정량하였다.
성능/효과
- 2% 및 225%로서 매우 효과적인 과산화지질(LPO)의 생성 억제효과가 인정되었다. SFP-2.5 및 SFP-5.0투여그룹은 mitochondria획분에서 대조그룹 대비 85.7% 및 81.9%의 산화단백질(OP)의 유의적인 생성 억제효과가 인정되었을 뿐만 아니라 microsome획분에서도 SFF-25 및 SFP-5.0그룸 은 대조그룹 대비 각각 16.7% 및 15.7%의 효과적인 OP의 생성 억게효과가 인정되었다. 뇌조직의 mitochondria획분 중에서 5FP-2.
- 0투여그룹은 패조그룹 대비 긱.각 12.9% 및 2L9%,13.2% 및 225%로서 매우 효과적인 과산화지질(LPO)의 생성 억제효과가 인정되었다. SFP-2.
- 실크 피브로인(SFP)의 투여에 의한 뇌조직중의 LPO의 생성에 미치는 영향을 비교하여 보면 Table 2와 같다. 뇌조직 획분중의 LPO의 생성에 미치는 실크 피브로 인(SFF) 투여에 따른 영향을 비교하여 보면 하루에 SFP그.5 및 SFP-5.0g/kg BW로써 6주 동안 투여한 결과, 뇌조직의 mitochondria획분에서는 SFP-2.5 및 SFP-5.0 투여그룹은10.37±0.44 및 9.30±0.92 nmol/mg pr아eiii로서 대조그룹(11.91 + 1.38 nmol/mg protein : 100%) 디비 87.1% 및 78.1 %로서, 각각 12.9% 및 21.9%의 매우 효과적인 LPO의 샘성 억제효과가 인정되었다. 또한 microsome획분에서 SFP-2.
- 7%의 효과적인 OP의 생성 억게효과가 인정되었다. 뇌조직의 mitochondria획분 중에서 5FP-2.5 및 SFP-5.0 투여그룹의 Mn-SOD의 활성은 대조그룹 대비 각각 11.2% 및 24.2%의 매우 효과적인 Mn- SOD활성의 증가효과가 인정되었다, 뇌조직의 cytosol획분 중에서 SFP-2.5 및 SFP-5.0투여그룹의 Cu/Zn-SOD의 활성은 대조그룹 대비 각각 77% 및 19.6%의 Cu/Zn-SOD 활성의 증가효과였지만, SFP-5, 0투여그룹에서만 유의성이 인정되었다. 또한 cytosol 획분의 GSHPx활성도 SFP-2.
- 한편 뇌조직 세포의 단백질 성분이 활성산소의 공격을 받아 생성되는 카르보닐 그룹의 생성에 미치는 실크 피브 로인의 투여효과를 평가하기 위하여 산화단백질(oxidized protein : OP) 의 생성량을 평가하여 본 결과는 Table 3과 같다. 뇌조직의 mitochondria획분애서 SFP-2.5 및 SFP-5.0 그룹의 OP의 생성은 11.31 + 0.97 및 11.12±1.13 ng/mg pmteirL으로서 대조그룹의 OP의 생성량(13.42±1.28 ng/mg protein : 100%) 대비 84.3% 및 81.9%로서, 각각 15.7% 및 1&1%의 Cμ의 생성 억제효과가 인정되었을 뿐만 아니아 microsome획분에서도 SFP-2.5 및 SFF-5.0그룹의 OP의 생성량은 11.88±1.25 및 12.02±0.98 ng/mg protein으로서 대 조그룹의 OF의 생성량(14.26±1.13 ng/mg protein : 100%) 대비 83, 3% 및 84.3%로서, 각각 16.7% 및 15.7%의 매우 효과적인 OF의 생성 억제효과가 인정되었다. 뽕잎 추출물(MLE)과 누에분말과는 달리 실크 피브로인은 뇌조직의 두 획분에서 매우 효과적인 OP의 생성 억제효과가 입증되었다는 사실은 매우 흥미로문 사실이다,
- 뇌획분중에서 활성산소의 제거효소로서 가장 중요한 수 퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 및 글루타치온 퍼옥시다아제 (GSHPx)의 활성에 미치는 실드L 피브로인(SFP) 투여의 영향을 분석하여 보면 Table 4와 같다. 뇌조직의 mitochondria획분중에서 SFP-2.5 및 SFP-5.0 ㎎/㎏ BW투여에 의한 Mn- SOD의 활성은 20.85 ±1.76 및 23.28±2.54 unit/mg protein 으로서 대조그룹(18.75±L47 unit/mg protein : 100%) 대 바 1U.2% 및 124.그%로서, 각각 11.2% 및 24.2%의 매우 효과적인 Mn-SOD활성의 증가효과가 인정되었다. 또한 뇌조직의 cytosol 획분중에서 SFP-25 및 SFP-5.
- 6%의 Cu/Zn-SOD 활성의 증가효과였지만, SFP-5, 0투여그룹에서만 유의성이 인정되었다. 또한 cytosol 획분의 GSHPx활성도 SFP-2.5 및 SFP-5.0투여그룹에서 대조그룹 대비 각각 5.3% 및 1L7%의 비교적 효과적인 GSHPx활성의 증가효과가 나타났지만, 마P5.0투여 룪에서만 유의성이 인정되었다. 따라서 뇌조 직의 ・OH 및 Oz 둥 활성산소의 생성을 효과적으로 억제 하이 LPO 및 QP의 생성 등산화적 스트레스를 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 Mn-SOD, Cu/Zn-SOD 및 GSHPx 등 제거효소의 활성을 효과적으로 증가시켜 뇌조직외 기능 저하를 매무 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 기대된다.
- 9%의 매우 효과적인 LPO의 샘성 억제효과가 인정되었다. 또한 microsome획분에서 SFP-2.5 맟 SFP50투여그룹은 10.63+0.76 및 9, 49±0.69 nmol/mg protein로서 대조그룹(12.24±1.01 nmol/mg protein : 100%) 대비 86.8% 및 77.5%로서, 각각 13.2% 및 22.5%의 LPO의 생성 억제효과가 인정되었다. 사실 뇌조직은 산화적 스트레스에 대하여 매우 민감한 조직이란 사실을 감안한다민 실크 피브로인(SFP)의 투여는 뇌조직의 독성물질로서 L.
- 2%의 매우 효과적인 Mn-SOD활성의 증가효과가 인정되었다. 또한 뇌조직의 cytosol 획분중에서 SFP-25 및 SFP-5.0 투여그룹의 Cu/Zn-SOD의 활성은 25.04 + 1.97 맟 27.80 ±2.24 unit/mg protein으로서 대조그룹(23.25 ±2.45 unit/mg protein : 100%) 대비 107.7% 및 119.6%로서, 각각 7.7% 및 19.6%의 비교적 효과적인 Cu/Zn-SOD 활성의 증가효과가 인정되었다. 한편 SFP25 및 SFP-5.
- 6%의 비교적 효과적인 Cu/Zn-SOD 활성의 증가효과가 인정되었다. 한편 SFP25 및 SFP-5.0투여그룹의 GSHPx으] 활성은20.34+1.78 및 21.56 ±1.55 IU/g protein으로서 대조그룹의 GSHPx 활성 (19.31 ±2.05 IU/g protein : 100%) 대비 각각105.3% 및 Ⅲ.7%로서, 각각 5.3% 및 11.7%의 실크 피브로 인의 투여에 의하여 비교적 효과적인 GSHPx활성의 증가 효과가 인정되었다.
- 0투여그룹에서 라디칼의 생성 억제효과에 대한유의성이 인정되었다. 한편 뇌조직의 cytosol획분의 superoxide radical(Q )의 생성 억제효과는 SFP-2.5 및 SFP-5.0투 여그룹에서 6-라디칼의 생성 억제효과는 37.90+2.90 및35.17±3.19 nmol/mg protein으로서 대조그룹(3&69±2.62 nmol/mg protein : 100%) 대비 98.0% 및 909%로서, 각각2.0% 및 9, 1%의 감소로서 Q-라디칼의 생성 억제효과가 나타났지만, SFP-5.0투여그룹에서 만 유의성이 인정 되었다.
후속연구
- 0투여 룪에서만 유의성이 인정되었다. 따라서 뇌조 직의 ・OH 및 Oz 둥 활성산소의 생성을 효과적으로 억제 하이 LPO 및 QP의 생성 등산화적 스트레스를 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 Mn-SOD, Cu/Zn-SOD 및 GSHPx 등 제거효소의 활성을 효과적으로 증가시켜 뇌조직외 기능 저하를 매무 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 기대된다.
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