효소 [CGTase : Cyclodextrin glucanotransferase]의 반응 조건이 산물 [CD : Cyclodextrin]의 특이성에 미치는 영향 The Effects of CD-product Specificity upon the Enzyme [CGTase] Reaction Condition원문보기
효소인 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제 (CGTase)는 효소의 활성도에 칼슘이 관련된 분자내 당 전이반응에 의해 녹말과 그에 관련된 $\alpha$-1,4-glucan의 기질을 싸이클로덱스트린으로 생성시키는 산업적으로 가장 많이 응용되는 효소 중에 하나이다. 수용성 녹말을 기질로 하여 CLEC화한 Bacillus macerans $\alpha$-CGTase 효소를 극한의 반응 조건인 계면활성제나 유기 용매가 혼합된 반응조건에서 실험한 결과, 이들 조건이 싸이클로덱스트린의 생산을 증가시키는 영향을 초래하였고 특히, 계면활성제인 SDS와 $\beta$-OG는 전체 싸이클로덱스트린의 생성을 증가시켰고 이 중에서 SDS와 Lubrol PX는 알파싸이클로덱스트린의 생성의 특이성의 결과를, 반면에 Triton x-100과 Tween 80은 알파싸이클로덱스트린의 생성을 억제하는 결과를 보였다. 유기용매인 DMSO, formamide, MPD, ethylene glycol 또한 사이클로 덱스트린의 전체 수율과 특이성에 영향을 미치는 효력을 보였다.
효소인 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제 (CGTase)는 효소의 활성도에 칼슘이 관련된 분자내 당 전이반응에 의해 녹말과 그에 관련된 $\alpha$-1,4-glucan의 기질을 싸이클로덱스트린으로 생성시키는 산업적으로 가장 많이 응용되는 효소 중에 하나이다. 수용성 녹말을 기질로 하여 CLEC화한 Bacillus macerans $\alpha$-CGTase 효소를 극한의 반응 조건인 계면활성제나 유기 용매가 혼합된 반응조건에서 실험한 결과, 이들 조건이 싸이클로덱스트린의 생산을 증가시키는 영향을 초래하였고 특히, 계면활성제인 SDS와 $\beta$-OG는 전체 싸이클로덱스트린의 생성을 증가시켰고 이 중에서 SDS와 Lubrol PX는 알파싸이클로덱스트린의 생성의 특이성의 결과를, 반면에 Triton x-100과 Tween 80은 알파싸이클로덱스트린의 생성을 억제하는 결과를 보였다. 유기용매인 DMSO, formamide, MPD, ethylene glycol 또한 사이클로 덱스트린의 전체 수율과 특이성에 영향을 미치는 효력을 보였다.
Cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19, abbreviated as CGTase) is one of the most applied industrial enzymes that produces cyclodextrins from starch and related ${\alpha}$-1,4-glucans by intramolecular transglycosylation reaction upon Ca$^<$TEX>2＋/ dependent manner. The reactio...
Cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19, abbreviated as CGTase) is one of the most applied industrial enzymes that produces cyclodextrins from starch and related ${\alpha}$-1,4-glucans by intramolecular transglycosylation reaction upon Ca$^<$TEX>2＋/ dependent manner. The reaction of CLEC, ${\alpha}$-CGTases from Bacillus macerans with the soluble starch as a substrate reveals that the surfactants (SDS, N-octyl-${\beta}$-D-glucoside) significantly affect not only the overall products of CDs but also their selectivity. The surfactants (SDS, Lubrol PX) trigger the increase of ${\alpha}$-CD production, but Triton x-100 and Tween 80 suppress ${\alpha}$-CD specificity. Organic solvents (dimethyl sulfoxide, formamide, 2-methyl-2,4-pentandiol, and ethylene glycol) also cause changes of total product and product selectivity.
Cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19, abbreviated as CGTase) is one of the most applied industrial enzymes that produces cyclodextrins from starch and related ${\alpha}$-1,4-glucans by intramolecular transglycosylation reaction upon Ca$^<$TEX>2＋/ dependent manner. The reaction of CLEC, ${\alpha}$-CGTases from Bacillus macerans with the soluble starch as a substrate reveals that the surfactants (SDS, N-octyl-${\beta}$-D-glucoside) significantly affect not only the overall products of CDs but also their selectivity. The surfactants (SDS, Lubrol PX) trigger the increase of ${\alpha}$-CD production, but Triton x-100 and Tween 80 suppress ${\alpha}$-CD specificity. Organic solvents (dimethyl sulfoxide, formamide, 2-methyl-2,4-pentandiol, and ethylene glycol) also cause changes of total product and product selectivity.
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문제 정의
본 논문에서는 Bacillus macerans에서 정제한 CLEC CGTase를 이용하여 계면 활성 제가 존재하는 조건에서 반응시킨 CD의 전체 수율과 생성물의 특이성에 관한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
5)에 30분 동안 themomixer (Eppendorf)에서 incubation 시킨 후에 CLEC CGTase들은 여과 (Amicon YM 30)에 의해 제거하였고 쇄상의 올리고당들은 methanol 침전(1 : 1, v/v)에 의해 분리하였다. 여과액을 원심 분리한 후에 HPLC (waters, U-Bodapa"탄수화물 분리 column; 30 x 7.5 cm, 유속: 0.8 ml/min)를 사용하여 생성된 CD들을 분석하였다. 이때 유동 상으로는 30% acetonitrile을 용매로 사용하였다.
6 x 95 cm)을 걸어서 활성 분획을 모은다. CGTase의 정제도와 활성도는 각각 SDS-PAGE와 HPLC를 이용하여 측정 한다.
5를 초과할 때 최대치를 보였다(자료 미공개). 본 연구에서는 이 점을 고려하여 모든 실험의 pH를5.5로 고정하여 실험하였다.
maceral에서 CGTase는 음이온 교환 colunm (DEAE - cellul ose)과 gelfilttation (superdex G-200)을 이용하여 순수하게 정제하였다. 정제된 CGTase는 상온에서 침전제로써 2025%의 PEG 6, 000을 써서 sitting drop vapor diffusion皆을 사용하여 결정화 시켰다(Fig. 1).
5% glutaraldehydes. 처리하여 CLEC (재료 및 방법 참조)으로 만들었다. 이런 CLEC화된 CGTase들은 CD를 생산하기 위한 실험에 사용되어졌다.
대상 데이터
계면 활성 제 (SDS, CTAB, Tween 80, Triton x 100, Lubrol PX, 와 N-octyl-f-D-glucoside) 와 유기 용매 (2-butanol, ethylene glycol, DMSO, MPD, 그리고 acetonitrile)는 Sigma사에서 구입 사용하였다.
이론/모형
처음의 결정화 조건을 찾기 위한 screene Jancarik과 Kim(18)에 의해 기술된 sparse matrix를 사용하였다. CGTase의 결정은 실온에서 150 mM NaCl, 5 mM CaCb를 포함한 0.1 M PIPES 완충 용액 (pH 7.0)에서 20-25% (w/v) PEG 6, 000을 침전제로 사용하여 sitting drop vapor diffusion법으로 Choe 등(17)에 의해 보고된 것과 같이 하여 결정화하였다.
0)에 철저하게 투석 시 킨 다음 YM 30 (Amicon)을 이용하여 ultrafiltration에 의해 20 mg/ml 까지 농축시 킨다. 처음의 결정화 조건을 찾기 위한 screene Jancarik과 Kim(18)에 의해 기술된 sparse matrix를 사용하였다. CGTase의 결정은 실온에서 150 mM NaCl, 5 mM CaCb를 포함한 0.
효소, CGTase는 B. macerans 균주 IFO 3490으로부터 Stavn, Granum(16)과 Choe 등(17)의 방법에 의해 분리 정제하였다. Crude extract는 B .
성능/효과
CD 생성의 특이성은 반응물의 pH에 의존하는 것으로 알려져 있다. B. maceranse CLEC CGTase의 a-CD 특이성은 반응물의 pH가 6 이하이거나 9.5를 초과할 때 최대치를 보였다(자료 미공개). 본 연구에서는 이 점을 고려하여 모든 실험의 pH를5.
5% v/v)에서는 P-CD의 수율을 증가시켜서 실험 조건에서 a-와 8-CD의 수율에 차이를 거의 볼 수 없었다. 그러나 이온을 띄는 계면 활성제 SDS 와 이온을 띄지 않는 N-octyl-D-D-glucoside의 첨가는 a-CD의 수율이 눈에 띨 정도로 증가하는 현상을 보였다. 반응물에 여러 유기 용매(25%, v/v)들 (2-butanol, ethylene glycol, DMSO, formamide, MPD, 와 acetonitrile)의 첨가는 아주 유사한 증가 현상(Fig.
용액 에서 모두 다 안정하였다. 또한 CLEC CGTase는 활성도를 감소시키지 않고 반복하여 사용할 수 있었다. 여러 계면 활성제 (Triton X-100, Tween 80, SDS, CTAB, Lubrol PX and N-octyl-P-D-glucoside) 가 들어있는 상태에서 CLEC CGTase와반응시켜 얻어진 CD의 수율은 Fig.
그러나 이온을 띄는 계면 활성제 SDS 와 이온을 띄지 않는 N-octyl-D-D-glucoside의 첨가는 a-CD의 수율이 눈에 띨 정도로 증가하는 현상을 보였다. 반응물에 여러 유기 용매(25%, v/v)들 (2-butanol, ethylene glycol, DMSO, formamide, MPD, 와 acetonitrile)의 첨가는 아주 유사한 증가 현상(Fig. 2b)을 보였고, 이는 CLEC CGTase가 아닌 용액 상태의 CGTase를 사용하여 연구 보고한 생성물의 수율이나 생성물의 특이성의 연구 결과와 일치하는 결과를 보였다(7-10).
실험 전반에 걸쳐 반응물에 계면 활성제 (0.5%, v/v)의 첨가하면 CD의 수율이 증가하는 결과를 보였다. 이온을 띄지 않는 계면활성제들 Triton x-100 (0.
생성을 억제하는 결과를 보였다. 유기용매인 DMS0, formamide, MPD, ethylene glycol 또한 사이클로 덱스트린의 전체 수율과 특이성에 영향을 미치는 효력을 보였다
후속연구
결론적으로 CLEC CGTase는 극한의 반응 조건에서도 효소의 활성도의 손실이 없이 CD의 수율이나 생성물의 특이성을 증가시킬 수 있는 생물 공학적 인 연구에 사용할 수 있으리 라 기대 한다.
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