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문제 정의
- 본 연구는 택서스속 (Taxus genus) 식물세포 배양액으로부터 회수한 식물세포와 식물세포조각 (debris)에 포함되어있는 paclitaxe을 효율적으로 대량 추출할 수 있는 공정에 대한 이해와 이를 토대로 한 최적화에 목적이 있다.
제안 방법
- HPLC (Waters) 분석 방법에 의하여 paclitaxel 함량을 분석하였으며(15) 모든 샘플은 3개씩 취하여 분석 후 평균값을 취하였다. 채취한 샘플 2 mL에 내부 표준 (internal standard) 용액 100 卩L (6.
- 5 mL 를 첨가하고 밤새 교반하였다. 교반 후 상등액을 취하여 amino propyl SPE cartridges (Alltech, Cat. #211025)를 통과시킨 후 methyl-t-butyl ether/methanol (85/15, v/v) 용액 3 mL로 세척하고 여액을 건조한 후에 0.5 mL 메탄올에 녹여 분석하였다. 분석에 사용한 컬럼은 Capcell Pak C18 UG 120 (250 mm X 4.
- batch 형태의 조업을 택하고 있다(13). 본 연구에서도 batch 형태의 추출방법과 메탄올을 이용하여 biomass (식물세포 및 세포조각)로부터 paclitaxel를 추출하는 공정을 최적화 하였다.
- 측정하였다. 분석조건은 120°C, 20분이며 모든 샘플은 3개씩 취하여 분석 후 평균값을 취하였다.
- 세포내의 수분함량을 측정하기 위하여 회수된 세포 5 g 을 채취하고 수분측정기 (Sartorius, MA30)를 이용하여 수분을 측정하였다. 분석조건은 120°C, 20분이며 모든 샘플은 3개씩 취하여 분석 후 평균값을 취하였다.
대상 데이터
- 0 niL/min, 샘플 주입량은 10 以L 이며 , UV (227 nm) detector를 사용하였다. Paclitaxel 표준물질은 Sigma 제품을 사용하였다.
- 이용하였다(14). 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여데칸터 (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter)# 이용하였으며, 식물세포조각 회수를 위하여 고속 원심분리기 (a-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하였다. 식물세포 회수후 건조를 위하여 drying oven (JISICO, J-DV01, Korea)과 freeze dryer (LABCONCO, 77555, USA)를 사용 하였다.
- 본 연구에 사용된 배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 cell line을 이용하여 3000 L 발효조에서 배양한 배양액을 이용하였다(14). 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여데칸터 (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter)# 이용하였으며, 식물세포조각 회수를 위하여 고속 원심분리기 (a-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하였다.
- 5 mL 메탄올에 녹여 분석하였다. 분석에 사용한 컬럼은 Capcell Pak C18 UG 120 (250 mm X 4.6mm), 컬럼 온도는 40°C, 이동상은 CHsCN/Water (20-100% gradient), 유속은 1.0 niL/min, 샘플 주입량은 10 以L 이며 , UV (227 nm) detector를 사용하였다. Paclitaxel 표준물질은 Sigma 제품을 사용하였다.
- 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여데칸터 (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter)# 이용하였으며, 식물세포조각 회수를 위하여 고속 원심분리기 (a-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하였다. 식물세포 회수후 건조를 위하여 drying oven (JISICO, J-DV01, Korea)과 freeze dryer (LABCONCO, 77555, USA)를 사용 하였다. 회수한 식물세포와 세포조각 (debris)을 합하여 biomass라 하였다.
성능/효과
- 추출에 사용된 메탄올의 농도 변화에 따른 추출효율을 Table 2에 나타내었다. 70% 메탄올을 이용하여 추출하였을 경우 4회에 걸친 추출에서 식물세포 내 paclitaxel 의 73%만이 회수 가능하였으며, 75% 메탄올인 경우 81%, 80% 메탄올인 경우 88%, 85% 메탄올인 경우 91%, 90% 메탄올인 경우 98%, 95% 메탄올인 경우 99% paclitaxel O] 회수되어 추출에 사용되는 메탄올의 농도가 90% 이상만 되면 식물세포 내 존재하는 대부분의 paclitaxel 회수 (>98%)가 가능하였다. 또한 메탄올 추출시 식물세포와 메탄올의 혼합비율에 따른 추출효율에는 거의 영향이 없었다 (Figure 6).
- 따른 추출효율을 비교하여 Figure 2 에 나타내었다. 데칸터로부터 회수한 식물세포 내의 수분함량은 70% 정도이며 dry oven을 이용하여 각각 50°C, 60°C, 70°C에서 건조한 결과 50°C에서는 2 hr, 60°C에서는 1.5 hr, 70°C에서는 1 址후면 식물세포는 완전히 건조됨을 알 수 있었다. 또한 이들 온도조건에서 건조 동안 식물세포 내 paclitaxel 함량변화는 5% 이내로 무시할 수 있었다.
- 또한 메탄올 추출시 식물세포와 메탄올의 혼합비율에 따른 추출효율에는 거의 영향이 없었다 (Figure 6). 따라서 혼합비율, 즉 식물세포/메탄올=1 Kg/1 L조건이 가장 경제적이며 메탄올의 양을 더 줄일 경우 혼합에 어려움이 있었다. Withertip 등(8)에 의하면 Taxus brevifolia 의 잎으로부터 CH2C12 고]-MeOH을 이용한 paclitaxel 추출에서 식물체와 유기용매의 비가 1 Kg biomass/16 L solvent로 상당히 많은 양의 유기용매를 사용하였다.
- Batch 형태를 이용한 메탄올 추출 시 식물세포의 경우 4회 (회수율>99%), 식물 세포 조각의 경우 1회 (회수율>96%)의 추출로 대부분의 paclitaxel 회수가 가능 하였다. 또한 메탄올 추출시 90% 이상의 메탄올 농도이면 충분하며 (회수율>98%), 추출시biomass와 메탄올의 혼합비 (Kg biomass: L MeOH)는 1:1, 추출시간은 1회 5 분 이상이면 적당 하였다. 메탄올 추출물에 포함된 극성불순물들은 다음 공정인 액/액 (methylene chloride/ MeOH) 추출로 제거하여 정제공정에 사용되어 진다.
- 식물세포 배양액으로부터 회수한 식물세포 내 수분 함량에 따른 추출효율은 건조 정도 보다는 건조방법에 상당히 영향을 받음을 알 수 있었으며 건조하여 추출할 경우 사용되는 추출용매를 절약할 수 있었다. 여러가지 유기용매를 이용하여 paclitaxel의 추출 경향을 조사한 결과 메탄올의 경우 가장 적은 양으로 가장 높은 paclitaxel 회수율을 얻어 가장 효과적임을 알 수 있었다.
- 추출용매를 절약할 수 있었다. 여러가지 유기용매를 이용하여 paclitaxel의 추출 경향을 조사한 결과 메탄올의 경우 가장 적은 양으로 가장 높은 paclitaxel 회수율을 얻어 가장 효과적임을 알 수 있었다. 추출방법의 경우 counter-current 형태를 사용할 경우 batch형태에 비하여 용매 사용량을 줄일 수 있으며 paclitaxel 회수율은 거의 차이가 없음을 알 수 있었다.
- Biomass 추출에서는 여러가지 조업방법이 가능하나 Figure 1에서 보는 바와 같이 크게 batch와 counter- current 형태로 나누어 작업이 가능하다. 이들 방법에 따른 paclitaxel 회수율은 Table 1에서 보는 바와 같이 거의 차이가 없음을 알 수 있었으며 (90% 이상 회수) 다만 counter current 형태를 사용할 경우 용매사용량을 줄일 수 있었다.
- 즉, 식물세포가 건조될 때 수축 현상이 생기며 이러한 수축과 확산도의 강하로 식물세포 내부로 유기용매가 스며들기 어렵게 되기 때문이다. 이를 확인하기 위하여 건조 방법을 달리하여 추출 효율을 확인한 결과 Figure 4 에서 보는 바와 같이 건조기에서 건조할 경우에는 추출효율이 조금 떨어지는 반면 동결건조 (freeze drying)한 경우에는 추출효율이 오히려 증가함을 알 수 있었다. 즉, 동결건조의 경우에는 표면경화가 생기지 않아 식물세포 표면이 다공성을 유지한 상태로 건조되기 때문에 유기용매 침투가 용이하여 추출효율이 증가하는 것으로 사료된다(16).
- 또한 평형과 추출시간에 미치는 온도의 영향은 5°C-50E에서는 거의 영향이 없었다. 추출 횟수와 biomass로부터 paclitaxel 추출 정도는 이미 보고한 바와 같이 1회 메탄올 추출시 40% paclitaxel이 회수 되었으며, 2회 32%, 3회 18%, 4회 9% 회수되어 총 4회의 추출로 식물세포 내 paclitaxel은 대부분 회수 (99%) 가능 하였다(15). 추출에 사용된 메탄올의 농도 변화에 따른 추출효율을 Table 2에 나타내었다.
- 여러가지 유기용매를 이용하여 paclitaxel의 추출 경향을 조사한 결과 메탄올의 경우 가장 적은 양으로 가장 높은 paclitaxel 회수율을 얻어 가장 효과적임을 알 수 있었다. 추출방법의 경우 counter-current 형태를 사용할 경우 batch형태에 비하여 용매 사용량을 줄일 수 있으며 paclitaxel 회수율은 거의 차이가 없음을 알 수 있었다. Batch 형태를 이용한 메탄올 추출 시 식물세포의 경우 4회 (회수율>99%), 식물 세포 조각의 경우 1회 (회수율>96%)의 추출로 대부분의 paclitaxel 회수가 가능 하였다.
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