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문제 정의
- 18), 피부세포 독성 완화 효과(L9), 항혈전효과(20)등 다양한 연구가 보고되고 있다. 본 연구는 김치중 지칠 저하 효과가 있는 활성 물질을 분리동정하기 위한 기초 연구중의 일환으로 전보에서 보고한⑵) 김치의 용매획분중 in 切g에서 LDL 산화억제 활성이 강했고折 uiuo 에서 지질 저하효과가 있었던 디卷로로메탄 획분. 에틸아세테이트 획분, 수용성 획분이 고콜레스테롤 식 이를 섭취한 토끼에 있어서 간의 지질 산화정도와 항산화효仝계의 활성 및 인 지방질의 지방산 조성이I 미치는 영향을 살펴보고자 하였다
- 물질을 보호하는 효소적 . 비효소적 항산화 시스템이 존재한다 이들 항산화게 효소의 활성에 김치욤매 획분이 미치는 영향을 살펴보았다. 간의 catalase 활성은 1% 콜레스테롤 식이를 십취한 대조군의 활성은 38.
- 본 연구는 김치중 지칠 저하 효과가 있는 활성 물질을 분리동정하기 위한 기초 연구중의 일환으로 전보에서 보고한⑵) 김치의 용매획분중 in 切g에서 LDL 산화억제 활성이 강했고折 uiuo 에서 지질 저하효과가 있었던 디卷로로메탄 획분. 에틸아세테이트 획분, 수용성 획분이 고콜레스테롤 식 이를 섭취한 토끼에 있어서 간의 지질 산화정도와 항산화효仝계의 활성 및 인 지방질의 지방산 조성이I 미치는 영향을 살펴보고자 하였다
제안 방법
- 0〜2 5 kg인 것을 사용하였고 고춧기耳는 경북 안동 일직농협조합에서 가공한 안동 청결 고춧가루, 마늘은 남해에서 재배된 것을 사용하였다. 김치 담금은 부산대학교 김 치 연구소에서 개발한 부재로의 양이 비교적 적게 첨가된 담금법(절인배주 1 kg, 고춧가루 18 g, 마늘 7.5 g, 생강 J.9 g, 젓駐 45 g. 찹쌜풀 12.8 g)으로 포기김치를 담아 냉장 온도에서 15일간 숙성시켰다. 숙성된 김치의 염도는 2.
- 김치 용매획분 섭취에 따른 LDL 산화 억제 효과를 in mg상에서 살펴보았다(Table 4). 토끼의 간 균질익을 정상인의 LDL과 함께 Cl严 존재하에서 산화시켜 생성되는 TBA.
- 김치에 들어있는 유기성분을 극섬을 달리한 용매를 이용하여 순차적으로 분획하였다. 동결건조 김치 시료를 분말로 만들어 헥산으로 3회 반복 추출하고 잔사울을 5베의 메탄올로 12시간 교반하여 3회 반복 추출하였다.
- 시료를 질소가스로 농축한 후. 냉동고에 보관하면서 실험직전 hexane 1 mL을 혼합하여 지질을 녹인 다음 1 皿를 취하여 가스 크로마토그■래피 (GC)로 분석하였다 GC의 분석조건은 다음과 같다. FID와 HP-Inowax fused-silica bonded cap column (30 mX 0.
- 순차적으로 분획하였다. 동결건조 김치 시료를 분말로 만들어 헥산으로 3회 반복 추출하고 잔사울을 5베의 메탄올로 12시간 교반하여 3회 반복 추출하였다. 메 탄올 추출물을 회 전식 진곰농축기를 이용하여 농축한 후、이틀 다시 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 용매 분획하여 용매를 제거하고 시험에 사용하였다(22).
- 세포질 분획을 13, 000 rpm에서 2。분간 원심분리하여 postmitochondria 분획을 얻었다. 그 상층액은 Cn, Zn-SOD 를, 침전물은M『SOD 측정용 시료로 시용하였다.
- 실험욤 식이에 첨가한김치용미〕 획분의 양은 돔결건조 김치로 환산하면 식이의 5%에 해당되는 양이다. 사료는 자유用会로, 식수는 제한 없이 섭취하도록 하였다. 동물사육실의 온도는 20°C, 상대습도는 55%를 유지하였으며 명암의 주기는 12시간 간격으로 조절하였디-.
- 에틸아세테이트획분그리고물(氏 0)획분을 5% 동걸건조김치에 해당되게 수율을 계산하여 식이에 첨가하여 16주간 사육하여 토끼 간 조직의 지질 산화 정도, LDL 산화 억제효괴、항산화 효소게, 인지짚 지방산조성 등을 살펴보았다. 간조직의 TBARS 및 FOV는 대조군에 비해 김 치 용매획 분 첨가 군에서 낮게 나타났으며 , 이들 추출물의 LDL 산화억 제 효과도 김 치 용매획 분 첨가군에서 높게 니타났다卩<0一。5).
- , v/v)을 가하여 지질을 추출한 후 용매를 휘발시켜 TLC용 시료로 사용하였다 Silica gel 60G(Merck)를 사용한 TLC plate에 spot한 다음 전개용매 (petroleum ether : ethyl ether: acetic acid, 82 : 18: 1, v/v/v)로 전개시켜 TLC plate를 충분히 건조시킨 후 LTV lamp를 쬐어 형광색으로 발색된 인지질 획분을 시험관에 긁어모았다. 이것을 chIorofonn-methano](2:L v/v)용액으로 추출한 후, 여과하고 질소 가스로 농축하였다 Lepage와 Roy의 방법(28)에 의 해 농축된 인지질 분획 을 methylation시 키 기 위 해 BF^-methanol(14%) 용액 2.5 mL과 혼합하여 에서 60분간 가열하였다. 이것을 찬물에서 식힌 다음 6% K2CO3 5 mL을 천천히 첨가하고 여기 에 hexane I eL을 가하여 혼합하고 1。분간 3000 rpm에서 원심분리하여 상층액을얻었다.
대상 데이터
- 세포질 분획을 13, 000 rpm에서 2。분간 원심분리하여 postmitochondria 분획을 얻었다. 그 상층액은 Cn, Zn-SOD 를, 침전물은M『SOD 측정용 시료로 시용하였다. Catalase는 Aebi의 방법 (24)으로 GSH-Px 활성 은 Flohe 등(25)으] 방법에 의해 기질로 과산화수소를 이욤하여 측정하였다 Cu, Zn-SOD, Mn-SOD 활성은 Oyanagm외 방법(26)으로 측정하였다.
- 07 k垠CFU/mL이었다. 김치를 동결건조 시켜(해노 경북포항) 용매획분용 시료로 하였다
- (USA) 제품을, 콜레스테롤은 대종기기에서 구입하여 사용하였으며 김치의 용매별 획분에 사용된 용매는 Junsei Chemical Cojjapan丿의 특급시약을 사용하였다. 마취제는 한림제약의 Entobar를 사용하였다.
- 동결건조 김치 시료를 분말로 만들어 헥산으로 3회 반복 추출하고 잔사울을 5베의 메탄올로 12시간 교반하여 3회 반복 추출하였다. 메 탄올 추출물을 회 전식 진곰농축기를 이용하여 농축한 후、이틀 다시 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 용매 분획하여 용매를 제거하고 시험에 사용하였다(22).
- 배주(Korean cabbage: Brassica pekiinensis)^: 김해 신-지서 출하된 포기 당 중량이 2.0〜2 5 kg인 것을 사용하였고 고춧기耳는 경북 안동 일직농협조합에서 가공한 안동 청결 고춧가루, 마늘은 남해에서 재배된 것을 사용하였다. 김치 담금은 부산대학교 김 치 연구소에서 개발한 부재로의 양이 비교적 적게 첨가된 담금법(절인배주 1 kg, 고춧가루 18 g, 마늘 7.
- 식이에 첨가할 김치 용매획 분은 in vitro 실험 에 서 LDL 산화 익 제 효과 및 in vivo 에서 지질저하 효과가 컸던(21) 디클로로메탄(CHKh) 획 분. 에틸아세 테 이 트(EtOAc) 획 분콰 항산화 효과는 다른 두군에 비훼 다소 떨어지나 식품첨가 시에 적용성이 큰 물 획분을 실험용 시료로 선정하였다(21). 식이는 기븐식이 (basal diet, Purina사 제품)에 1% 콜레스테롤울 첨가하여 내조군 식이로 하였으며, 대조군 식이에 CHQ?획 분 8.
- 행하였다. 정상대조군용으로 3마리를 같이 사육하여 비교군으로 사용하였디..
- 토끼 (New Zealand white rabbit)를 대한실힘 동물센터 (대구에서 분양 받아 각군당 G마리씩 총 4군으로 화여 실험을 행하였다. 정상대조군용으로 3마리를 같이 사육하여 비교군으로 사용하였디.
- 토끼 는 희 생 전 24시 간 절 식 시 킨 후, EntobardOO mg)와 혜파린 혼합액을 후이개 정맥에 주사하여 마취시킨후 개복하였다 헤파린으로 처리한 별균주사기를 이용하여 심장에서 약 30 mL정도의 혈액을 채취하였다. 리고 간과 심 장, 대동맥 듬의 조직을 적출하여 0.
- 항산화 효소계 부석용 효소는 Sigma Chemical Co. (USA) 제품을, 콜레스테롤은 대종기기에서 구입하여 사용하였으며 김치의 용매별 획분에 사용된 용매는 Junsei Chemical Cojjapan丿의 특급시약을 사용하였다. 마취제는 한림제약의 Entobar를 사용하였다.
데이터처리
- "Data were significantly different analyzed by one-way ANOVA followed Duncan's multiple range test at the 0 05 level of significance.
- 실험길과는 평균 士 표준펀차로 나타내었고 각 군간의 유믜 성은 one-way ANOVA로 검증한 후 유의성이 발견되면 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- 그 상층액은 Cn, Zn-SOD 를, 침전물은M『SOD 측정용 시료로 시용하였다. Catalase는 Aebi의 방법 (24)으로 GSH-Px 활성 은 Flohe 등(25)으] 방법에 의해 기질로 과산화수소를 이욤하여 측정하였다 Cu, Zn-SOD, Mn-SOD 활성은 Oyanagm외 방법(26)으로 측정하였다. 간 균씰액을 13, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 농도별로 히석하여 시료로 사묭하였다.
- 의해 LDL을 분리하있다. 간 균질액(homo官b nate)을 LDL용액(100 Jig LDL prot/mL)에 첨가하고 Cu2+ 의 최 종농도가 2 이 되 도록 첨 가하여 2시 간 동안 40°C 에서 산화시킨 후 생성된 TEARS의 농도는 Buege와 Aust(23)의 방법으로 측정하였다.
성능/효과
- EtOAc 획 분 첨 가군 4 35 ninoL/g tissue 그리 고 瓦。획 분 첨 가군 4.52 nmoL/g tissue로 대 조군이] 비 해 CH?C1 회 분 첨 가군 46%, EtOAc획 분 첨 가군 24% 二/■리 고 FEQ획 분 첨 가군이 21% 정도 낮아 LDL 산화가 억제되었음을 알 수 있었다 (p<0.05). 이러한 결과는 김치 용매획분 첨가 식이를 섭취한 군에 있어 서 간의 지질 과산화가 억제되어 n.
- 1에 제시하지 않았슴)에 비하TI 활싱이 증가하였다 이는 1% 콜레스테롤 섭취에 의한 산화적 스트레스로 생성된 유리기를 제거하기 위해 활성이 증가한 것으로 생각된다. 데조군 식이에 CH? CE획분을 첩 가군의 catalase 활성 은 30 70 mU/mg protem/min, EtOAc획분 첨가군 32 47 mU/mg protein/min 그리고 HM)획분 첨가군 32.57 mU/mg protein/min으로 대조군에 비해 C压Ch획분 첨가군 19%, EtOAc획분 첨가군 15% zl리고 HQ획분 첨가군에서 15% 감소하여 모든김치용매획분 첨가군에서 활성이 낮은 경향이나 각 군간의 유의적 인 차이는 없었다(Fig. 1). 김치 용매획분을 첨가한 식이군에서는 고콜레스테롤 식이를 섭취하였음에도 불구하고 catalase의 활성 이 낮아진 것은 김 치용매획분군에서 지질산화가 늦게 진행되벘기 때문이다.
- 23 NU/mg protein/min으로 대조군에 비 해 CH2GI2획 분 첨 가군 27%. EtOAc획분 첨가군 43%, 그리고 획분 첨가군에서 75% 감소하였다 (Fig 3). Cu, Zn-SOD 활성은 catalase나 GSH-Px와는 날리 1% 콜레스테롤 식이군인 데조군의 활성도 정상 대조군(J8.
- 이러한 효과는 CH2CI2획 분 첨 가군에서 가장 현저 하였으며 콜러] 스테롤을 섭취하지 않은 정상군의 활성과 유사하였다. Kwon 등⑼은 식이에 1% 콜레스테롤을 첨가하고 여기에 배추, 고주 그㈢고 마늘을 각각 8, 1, l%(w/w) 첨가 한식이를 토끼에제 12주간 섭취시킨 결과 간의 catalase 함량은 대조군에 비 해 베추군은 19% 감소하였고, 고춧가루 군은 19%. 그리고 마늘군은 106% 증가하였다고 보고하였다
- Mn-SOD활성은 대조군 3.20 NU/mg protein/min, CHQh획 분 첨 가군 1 54 NU/mg protein/min, ElOAc획분 쳠 가군 L81 NU/mg protein/min 그리 고 H2O획분첨가군이 1.65 NU/mg protein/min으로 대조군에 비 해 CHaCh 획부 첨가군 51%, ElOAc획분 첨가군 43%, 压0획분 첨가 군에서 48% 감소하였으며. 데王군의 활성도 Cu, Zn- SOD 처럼 청상대조군(늬.
- 59 二리고 L70%으로 가 군간에 유의적인 차이 는 없 잌1 匸扌. 간무게 는 데 王군이 95.23 g, CH2CI2획 분 첨가군 66.90 g, EtOAc획 분 첨가군 92.90 g 그리 고 压O 획분 첨가군은 86.44 g으로 대조군에 비해 김치 획분 첨 가군의 간 무게가 유의적으로 가벼웠으며, 특히 CEfcCh 획분 첨가군의 간은 데조군에 비 해 30% 정도 가벼 웠다(P<0.05). 헤부시 정상데조군의 간이 선홍색 인데 비해 모든 군의 간은지방■침착에 따라 분홈색이었고 비대해져 있었으며 1" 콜레스테롤 식이를 한 대조군에 비해 김치용매획분 첨가군에서 지방 축적 현상이 덜 하였디-.
- 간조직의 TBARS 및 FOV는 대조군에 비해 김 치 용매획 분 첨가 군에서 낮게 나타났으며 , 이들 추출물의 LDL 산화억 제 효과도 김 치 용매획 분 첨가군에서 높게 니타났다卩<0一。5). 간의 항산화효소계 인 catalase와 GSH-Px, Cu, Zn-SOD 및 Mn-SOD의 활성은 1% 콜레스테롤 식이군인 대조군에 비해 김치 용매획분의 첨가군에서 활성이 낮았으며 이는 김치 용매획분 첨가군의 지힐 산화정도가 대조군보다 낮았기 때문에 효소 활성이 증가되지 않은 것으로 생각된다. 이러한 김치용매획분의 항산화 효과는 디클로로메탄획분 첨가군에서 가창 현저 하였다.
- 2에 제시하지 않았슴)에 비해 1% 콜레스테롤 첨가군 의의 활성이 증가하였는데 이는 지질과산화 현상이 빠르게 진행되었기 때문으로 생각된다. 데조군에 비해 GSI-1-Px 활성은 CHK2획분 첨가군 27%, EtOAc획분첨가군 19% si리고 H扣획분 첨가군 18% 감소하였다 (Fig 2, p<0.05). Kwon 등⑼은 돔일한 논문에서 배추, 마늘, 고추를 1% 콜레스테롤 식이에 첨가하여 토끼를 사육하였을 때 GSH-Fx 활성은식이군간이 유의적인 차이가 없었다고 보고하였디-.
- 63 nmoL MDA/g tissue, CH2CI2획분 첨가군 7.95 nmoL MDA/g tissue, EtOAc획 분 첨가군 9 39 nmoL MDA/g tissue 그!리고 凫0획분 첨가군이 9.66 nmoL MDA/g tissue로 대조군에 비해 CHKb획분 첨가군 63%, EtOAc획분 첨가군 56% 그리고 压0획분 침가군 55% 정도 낮았다(Table 3, p<0.05) POV는 대조군 33.82 卩 moL/g tissue, CH2CI2획 분 첨가군 22.73 UmoL/g tissue, EtOAc획 분 첨 가군 31 00 UmoL/g tissue 二z리 고 FLO획분 첨가군 32.99 UmoL/g tissue으로 디조군에 비헤 CH’CM획 분 첨 가군이 32% 점 도 낮게 나타났다(p<0.05). CH2C2획분 첨가군에 있어서 1% 콜레스테롤이 첨가되었음에도 불구하고 간에서 지질 과산화가 적게 진행된 깃은 김치 욤미확분 섭취군의 혈장 중성지방 및 콜레스테롤 농도가 낮았고 더 불어 VLDL 그리고 LDL-C 듬이 낮았던 겸고卜 때문으로 생기-된다 Kim의 보고(1D에 의화면 1% 콜레스테롤에 김치 용매획분을 첨가한 식이를 섭취시킨 토끼 간의 콜레스테롤 농도는 데조군에 비 해 CH2C13 획분 첨가군 79%, EtOAc획 분 첨 가군 48% 그리 고 HQ 획 분 첨 가군 49% 정도 낮았으며 (p<0.
- 토끼의 체중 중가량 및 간무게는 Table 2에 나타내었 다. 사육초기의 각 군의 토끼의 평균 체중은 2,100+210 g 정도였고, 사육 W주 후에는 대조군이 2.560 + 484 角 C］土囲2획분 첨가군 2.543 ±714 g, EtOAc획분 첨가군 2,973 + 201 g, 그리 고 压0획 분 첨 가군 2,673±511 g으로 체중이 증가하였다. 이들의 주당 체중증가율은 각각 1.
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