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문제 정의
- 으로 인류의 질병을치료하는새로운 지식이 전게되고있으며 나아가 분석적인 서양식 검색 방법이 접목되어 천연물로부터 새로운 항맘 및 암 예방 활성 물질 창출의 가능성이 높을 것으로 생각되고 있다. 본 연구는 우리 식 생활 주변에서 손쉽게 구할 수 있고 애용되고 있는 식품인 당근 싱분 중 생리활성 물질을 규명하고자 인체 암세포에 대한 세포독성 효과 즉, 항암성 여부를 알아보고자 본 연구를 시도하게 되었다. '
제안 방법
- 시료로 사용한 당근 CDaucuscarotaa L.) 뿌리와 씨 앗은 흐르는 물에 깨끗이 씻고, 일정한 크기로 자른 후 그늘에서 건王시킨 후 분쇄하여 -30"C의 냉돔고에 보관하있다 건圣된 시료 중 뿌리 ①CR)는 220 g에 methanol 1.5 L를넣고 추출하였으며, 당근 씨앗(DCS)의 경우 975 g에 metli- anol L5L를 가해 각각 3회씩 추출하여 회전식 진공 농축기로 농축한 후 동결건조하여 각 mathanol 추출물로 사용하였으며, methanol 추출물은 다시 n-hexane, ethy]- acetate, butanol 및 물가용무로 각 과징을 거쳐 분배 후취하고, 각 분可층은 농축하여 건조 시 킨 뒤 분말로 만들어 사용하였다.
- 였고, 각각의 시료는 DMSO에 녹여 100, 200, 300. 400 및 500 μg/well의 농도로 첨가하여 场시간 동안 다시 배양하였다 이 매양액예 MTT용액을 각각 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 매양 시킨 후, well 바닥에 형싱된 formazaii이 흩어지지 않게 조심스럽게 다루어 aspiraEr로 상등到을 제기하였다. 형성된 formazan 에 DMSO4 EtOII을 1 : 1로 혼합한 용可 1 mL씩 을 첨 가히.
- 비 교화기 위해 딩. 근으로부터 추출한 p-cai-otenceSig- ma사에서 구입하여 뽄 실험 추출물의 세포독성효과와 비교 측정하였다.Fig.
- in 1佬广。세포독성에 관한 연구에서 사용되어온 dye exclusion Lest나 [3HJ-thymidine uptake assay와 비교 시 실험 조작이 매우 간편하고 재현성이 우수하여 세포 독성 여부 대량검색이나 초기 검색단계에 적담한 방빕으로 많이 이용되고 있다(14) 그러므로 본 연구에서는 각 세포주를 ixlOeEis/mL 되게 세포 수를 조정하여 24 well plale°l| 1 mL씩 분주하고, 羽시간 동안 배양(37℃, 5% CO2) 흔! 후 무처리 구인 control군에는 dimethylsiilfoxidefDM- SQ)로 독성 실험믈 히.였고, 각각의 시료는 DMSO에 녹여 100, 200, 300.
- 형성된 formazan 에 DMSO4 EtOII을 1 : 1로 혼합한 용可 1 mL씩 을 첨 가히. 여 충분히 녹인 lJV-specti_ophotomcter(PhannaciEi Biotech 8Q-2105 也)를 이욤화여 570 mn에서 흡광도 값을 측정하여 제 현싱 여부를 검 토한 후 첨 가 시료의 맘 세포주에 대한 세포독성 여부를 비교 분석하였다
- )의 브A리오】- 씨앗은 98년에 수확한 것으로서 뿌리는 양산 임기 당근 밭에서, 씨앗은 동부한농 종묘에서 고입하였다. 이 시료들을 추출, 분획하여 가 암세포 주에 의한 에세포독성효고]-(cytotoxicity) 에 사용하였다. 추가 비교 실험을 통헤 당근으로부터 추출한 0-carotene을 Sigma사(St.
대상 데이터
- 당근 뿌리 (DaucLis carota L., DCR)를 음건 후 이 건소된 당근 220 g을 melhanE로 추출하여 추출물 74 97 g을 얻었다. 이 methanol 추출물(DCRM)을 n-hexane, etlivl- acetate 닟 butanol의 각 용매 별 계 톰 분획 에 의하여 분매하여 n-hexane분배층(DCRMH)은 2 85 g, ethylacetate 분베총①GRMEA)은 2.
- 본 실험에 사용한 딩근(Etocus carota L.)의 브A리오】- 씨앗은 98년에 수확한 것으로서 뿌리는 양산 임기 당근 밭에서, 씨앗은 동부한농 종묘에서 고입하였다. 이 시료들을 추출, 분획하여 가 암세포 주에 의한 에세포독성효고]-(cytotoxicity) 에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 암세포 주는 인체 간암세포인 HepG2 (human hepatocellular carcinonia), 유방암시포인 MCF7 (humanbreast adenocarcinoma pleual effusion), 난소암세포인 SW626(hQman ovary adenocarcinoma), 자궁경부임'세포인 HeLa(human cennese adenocarcinoma), 신경교종 세포인 C6(m°usc glioma) 및 신경 아세포■인 NB 41A3(mouse neuroblast)로서, 1999넌 3월 대전 소지] 한국과 학기 술원 생명 공학연구소로부터 분양받아 37℃, 5 % CO2 incubalor에서 刘먕하여 사용하였다.
- 이 시료들을 추출, 분획하여 가 암세포 주에 의한 에세포독성효고]-(cytotoxicity) 에 사용하였다. 추가 비교 실험을 통헤 당근으로부터 추출한 0-carotene을 Sigma사(St. Louis, USA)로 부터 구입하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 100 Hg/mL. 200 μg/mL, 300 Ug/mL, 400 Ug/mL 및 500 蛇/mL씩 점차 증가시키면서 세포주에 첨가한 결과 당근 뿌리 (DCR)추출물에서 는 DCRMEA에서 가장 높은 세포듁싱효과를 나타내었고, 당근 씨앗(DCS) 추출물에서는 DCSMA을 제외한 DCSM, DCSMH, DCSMEA 및 DCSMB애 서 거의 비 슷하기 99.5%의 아주 높은 암시] 포 저해효과를 나타내었다
- 근으로부터 추출한 p-cai-otenceSig- ma사에서 구입하여 뽄 실험 추출물의 세포독성효과와 비교 측정하였다.Fig. 14에서 보듯이 본 실험에 사용했던 6종으] 암세王予인 HepG2, I-IcLa, MCF7, SW626, C6 및 NB 41 A3에 본 실험의 최종 농도인 500 pg/mL씩 -carotene음 첨가하였을 때 HepG2세포주에서는 304%의 세포독성효과를 보였으며, HeLa세포주에서는 8.5%. MCF 7세 포주에서는 23.
- MTT assay를 통한 세포독성 효과 측정 걸 괴-, 당근 뿌리와 씨앗의 methanol 추춘룰과 각용미] 분내층의 첨가물의 농도가 증가함에 따라 사용흔} 6종의 암세포주에 대한 세 포독성 효과가 비볘 적으로 증가하였다. 특히 당근 뿌리추출액의 ethyiacelate층에서는 다른 용매츰과는 뚜렷이 구변-되므로써 6종류의 인제 맘세至주에 대해 높은 세포독섬 효과를 보였으며, 당근 씨앗에서는 실험에 사용한 6종의 암세포주에서 추출분의 농도가 50。μg/mL일 때 모두 DCSMA를 제외한 DCSM, DCSMH, DCSMEA 및 DC- SMB에서 공통적으로 99% 이상의 높은 세포 독성 효과를 보였다.
- 암세포주에서 추출분의 농도가 50。μg/mL일 때 모두 DCSMA를 제외한 DCSM, DCSMH, DCSMEA 및 DC- SMB에서 공통적으로 99% 이상의 높은 세포 독성 효과를 보였다. 본 실힘결 과와 비교하기 위해 당근으로부터 추출한 P-carotenci- 구입하고 동일한 조건 하에서 6종의 암세포주에 첨가하였을 때 본실험 결과에서 나타난 세포독성효과에 비해 그 효과는 아주 미약하였다.
- 6-Carotene의 경우 당근 추출물과 분배층을 사용한 몬 실험 결과에서 나타난 세포독성 효과와 비교헤 보았을 때. 당근 중 대표적 활성 물실로서는 이제까지 널리 알려진 provitamin A인 0-carotene이 아닌 디른 물질도 암세포 독성에 대한 활성효과가 있음을 본 실험을 통헤 유추할 수 있었다. 더우기 지용성 인 P- carotcnee benzene, chloroform 및 hexane 등 유기 용내에 만 녹는 지용성 물질로서, 당근 뿌리추출성분에서 볼 것과 같이 극성과 비극성 물질을 모두 추출해 내는 ethyl- acelatc층에서 아주 강한 세포독성효과를 보였으며 본 걸과이] 따르면, ethylacctate 층에 암세포포 생리활성 물질이 있는 것으로 생각되어진다.
- 1%, DCRMEA가 488%의 암세포 사멸효과를 보여 앞서 HepG2와 HcLh세포주의 세포독성효과 결과에 비해서는 아주 미으¥하였다. 또 당근 씨앗 추출물에서는 HepG2와 HcLa의 결과와 거의 비슷하여 DCSMA를 제외한 나머지 4개의 용미] 층에서는 95% 이상의 암세포 사멸 효과를 보였다.
- 8에 나타난 당근 뿌리를 첨가한 경우 DCRMEA의 농도를 100, 200, 300 gg/iiiL 가했올 메 MCF7 세 포주 결과와 비슷하게 세포독성 효과가 미 약하였 으나 500 Pg/mL 첨가시 약 64% 효과를 나타내었다. 또 당근 씨앗에서 는 DCSM, DCSMI-I 및 DCSMEA의 경우 각각 99%, 99 5% 및 98 6%의 세포독성효과를 보여 HepG2, HeLa 및 MCF7의 결과와 二L 효과가 거의 비슷하였으나, DCSAffi 의 경우는 HepGZ오】. HeLa 및 MCF7세포주에 비해서 약 80%로 二l 효과가 王금 미약하였다,
- 더우기 지용성 인 P- carotcnee benzene, chloroform 및 hexane 등 유기 용내에 만 녹는 지용성 물질로서, 당근 뿌리추출성분에서 볼 것과 같이 극성과 비극성 물질을 모두 추출해 내는 ethyl- acelatc층에서 아주 강한 세포독성효과를 보였으며 본 걸과이] 따르면, ethylacctate 층에 암세포포 생리활성 물질이 있는 것으로 생각되어진다. 또 당근 씨앗의 겅우에서도 극성과 비극성 용매에서 추출하고 분讯]되는 methanol, erlijdacetate, butanol 및 hexane층에서 아주 높은 시]포독성 효과를 나타내었으므로 본 실험 결과에서 보여준 각 추출물과 분배층에 새로운 세포독성효과를 가진 물질이 있음을 본 변구를 통헤 확인할 수 있었다
- 본 실힘결 과와 비교하기 위해 당근으로부터 추출한 P-carotenci- 구입하고 동일한 조건 하에서 6종의 암세포주에 첨가하였을 때 본실험 결과에서 나타난 세포독성효과에 비해 그 효과는 아주 미약하였다. 또한 간암 세포주인 HepG2룔 헌미경으로 관찰한 결과 각첨가물의 농도가 증가할수록 암세포의 수가 저하-되었고. 세포들의 부착능력이 없어 지민서 증식이 감소되었음을 육안으로 확인할 수 있었다
- 특히 당근 뿌리추출액의 ethyiacelate층에서는 다른 용매츰과는 뚜렷이 구변-되므로써 6종류의 인제 맘세至주에 대해 높은 세포독섬 효과를 보였으며, 당근 씨앗에서는 실험에 사용한 6종의 암세포주에서 추출분의 농도가 50。μg/mL일 때 모두 DCSMA를 제외한 DCSM, DCSMH, DCSMEA 및 DC- SMB에서 공통적으로 99% 이상의 높은 세포 독성 효과를 보였다. 본 실힘결 과와 비교하기 위해 당근으로부터 추출한 P-carotenci- 구입하고 동일한 조건 하에서 6종의 암세포주에 첨가하였을 때 본실험 결과에서 나타난 세포독성효과에 비해 그 효과는 아주 미약하였다. 또한 간암 세포주인 HepG2룔 헌미경으로 관찰한 결과 각첨가물의 농도가 증가할수록 암세포의 수가 저하-되었고.
- 15에서 보듯이 세포에 첨가물의 농도가 증가할수록 암세포의 그 수가 저하되었고. 세포의 부착 능력이 없어지먼서 암세포의 증식이 감소되었음을 확인할 수 있었다
- 또 당근 씨앗(DCS)에서는 HepGZ세포주와 같이 HeLa세포주에서도 물분배층을 .제외한 나머지 4개의 분배층 DCSM, DCSMH, DCSMEA 및 DGSMB에서 높은 암세포 사멸효과를 보였다.
- C6오]- NI匏:LA3에 대한 당근 平리 의 DCRMEA 첨 가시 HcpG2, HeLa 및 SW626세 至주들에서와 같은 감한 독성효과를 나타내 있다. 즉 C6 와 NB4LA3의 두 세포주 모두 DCRMEA 첨 가시 99.7%의 세포 사멸효과를 보였으며 당근 씨앗에서는 두 세포주 모두 HcpG2, HeLa, MCF7 및 SW626의 세포독성 효과에서와 같이 DCSMA# 제외한 4개 총에서 아주 뫂은 암세포사멸 효과를 보였다. Fig.
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