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문제 정의
- 그런데 국내에서 새로 육종된 자미의 구조에 관한 연구는 아직 이루어지지 않고 있는 실정이어서 본 연구에서는 국내에서 새로 육종하여 보급하기 시작한 자미의 anthocyanin색소의 구조를 밝히기 위한 기초 연구로서 paper chromatography, spectrophotometer 및 HPLC 등의 기기분석을 통하여 자색고구마 anthocyanin 색소의 aglycone, 당 및 acyl group 등을 동정하였다.
제안 방법
- 1% HC1 함유 methanol로 추출하였다. Paper chromatography에 의해 분리된 개별색소를 Sep-pak(Cis type) 으로 정 제 하고 membrane filter(Gelman Acrodisc LC 13 PVDF, 0.2 Um)로 여과한 후, n-Bondapak Cis(3 mmx 300 mm) column을 사용한 HPLC system(Waters 510, Waters사, USA)에 의해 분석 하였다, 이때 이동상은 FWM (formic acid : water: methanol, 7 : 63 : 30, v/v/v), 유속은 1.0 mL/min, 검출기는 Waters 486 tumable absorbance detectoi를 사용하여 530 nm에서 측정하였다.
- 2 Um)에 통과시 켰다. 기지 물질인 phloroglucinol, protocatechuic acid, wanillic acid, gallic acid, p-hydroxy-benzoic acid, syringic acid 등을 이 용총}■여 Table 1에 나타낸 조건에 따라 역상 HPLC를 사용하여 확인하였다.
- 분리된 각 개별색소들은 하단으로부터 순서에 따라 band 1, 2, 3로 구분하였으며 분리된 색소대를 취하여 0.1% HC1 함유 methanol로 추출하였다. Paper chromatography에 의해 분리된 개별색소를 Sep-pak(Cis type) 으로 정 제 하고 membrane filter(Gelman Acrodisc LC 13 PVDF, 0.
- 소량의 정제된 색소를 Abe-Hayashi 방법 (26)으로 시험관에 넣고 1.5 2의 2 N HC1 을 가하여 가열하면서 0, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 60분 간격으로 분해물을 분취하여 Whatman No. 1 paper에 각각 점으로 찍 어 용매 계 AHW 로 전개하였다.
- 방치하였다. 여기에 2 N HC1 1 mL를 가한 후 ethyl ether로 acyl compounds를 추출한 다음 회 전 감압농축기로 완전 농축시 킨 후 methanol에 용해시 켜 표준물질 인 chlorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid, o~coumaric acid, p-coumaric acid 등을 이용하여 Table 1 에 나타낸 조건에 따라 HPLC를 사용하여 acyl group을 확인하였다.
- 이 분해 액을 ice-water bath에서 냉각한 후 Albach 등(27)의 방법에 따라 isoamyl alcohol로 aglycone 을 제거하였고 ethyl ethers 불순물을 제거하였다. 이 액을 중화시킨 후 기지당인 glucose, xylose, fructose 등을 이용하여 BPW(n~buthanol: pyridin : water, 6 : 3 : 1, v/v/v)를 전개용매로 하여 paper chromatography# 행하였고 Table 1의 조건으로 HPLC system을 이용하여 결합당을 확인하였다.
- 정제용 시료는 회전감압농축기(Biichi, R-124, Switzerland)를 사용하여 40℃에서 농축한 후 농축액을 분액여 두를 사용하여 petroleum ether로 지용성 색소인 chlo~rophyll과 carotenoid 및 기타 지질성분 등을 제거하였으며, 이 과정을 3회 반복하여 실시하였다. 이렇게 얻어진 색소 추출액 중에는 여전히 anthocyanin 이외에 다른 불순물이 섞여 있으므로 anthocyanin-^ 정제와 농축을 위해 양이 온교환수지 관을 통과시 켜 유기 산, 유리 당류 등을 제거하였다. 수지관은 Moms 등(23)의 방법에 의해 Amberlite IRC-50을 관에 충진하고 사용전에 5% HC1 용액을 주입하여 H*형으로 활성화시켜서 사용하였다.
- 이온교환 수지관을 통과시켜 정제한 혼합색소용액을 Whatman 3 MM paper로 AHW( acetic acid: HC1: water 二 15 : 3 : 82, v/v/v) 용매계를 사용하여 개별색소를 분리하였다. 분리된 각 개별색소들은 하단으로부터 순서에 따라 band 1, 2, 3로 구분하였으며 분리된 색소대를 취하여 0.
- 자색고구마 anthocyanin 색소의 acyl group에 대한 분석은 각각의 색소 band에서 얻어진 색소에 대하여 알칼리 분해 하여 acyl compounds를 얻 었다. 표준물질은 chiorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid, o-coumaric acid, p-coumaric acid 등을 대상으로 하여 HPLC분석을 행 하면서 동일 용출시간대의 peak를 관찰하였다.
- 추출액을 모두 모아서 anthocyanin 색소의 정 제용 시료로 사용하였다. 정제용 시료는 회전감압농축기(Biichi, R-124, Switzerland)를 사용하여 40℃에서 농축한 후 농축액을 분액여 두를 사용하여 petroleum ether로 지용성 색소인 chlo~rophyll과 carotenoid 및 기타 지질성분 등을 제거하였으며, 이 과정을 3회 반복하여 실시하였다. 이렇게 얻어진 색소 추출액 중에는 여전히 anthocyanin 이외에 다른 불순물이 섞여 있으므로 anthocyanin-^ 정제와 농축을 위해 양이 온교환수지 관을 통과시 켜 유기 산, 유리 당류 등을 제거하였다.
- 1에 나타낸 바와 같이 자색고구마 100 g을 2 mm 크기로 세절한 후 1% HCl 함유 methanol을 시료가 완전히 잠기도록 가하여 4℃의 암소에서 24시간 방치하면서 색소를 추출하였다. 추출이 끝난 후 색소추출액을 분리하기 위하여 Whatman No. 1 여 과지 를 사용한 Buchner furm이을 사용하여 흡인여과하고 잔사는 고구마 색소가 완전히 제거될 때까지 동일 용매를 사용하여 3회 반복 추출하였다. 추출액을 모두 모아서 anthocyanin 색소의 정 제용 시료로 사용하였다.
- 분해 하여 acyl compounds를 얻 었다. 표준물질은 chiorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid, o-coumaric acid, p-coumaric acid 등을 대상으로 하여 HPLC분석을 행 하면서 동일 용출시간대의 peak를 관찰하였다. 그 결과 Table 3에 나타내 바와 같이 band 2의 용출시 간(14.
대상 데이터
- 자색고구마(자미)는 전남 무안에서 재배한 것으로 수확 후 상대습도 85%, 온도 13℃로 조절된 항온항습기 (HB-105S, 한백)에 보관하면서 시료로 사용하였다. 표준물질로서 사용된 유기산 및 당류는 Sigma Chemical사 (St.
- 1 여 과지 를 사용한 Buchner furm이을 사용하여 흡인여과하고 잔사는 고구마 색소가 완전히 제거될 때까지 동일 용매를 사용하여 3회 반복 추출하였다. 추출액을 모두 모아서 anthocyanin 색소의 정 제용 시료로 사용하였다. 정제용 시료는 회전감압농축기(Biichi, R-124, Switzerland)를 사용하여 40℃에서 농축한 후 농축액을 분액여 두를 사용하여 petroleum ether로 지용성 색소인 chlo~rophyll과 carotenoid 및 기타 지질성분 등을 제거하였으며, 이 과정을 3회 반복하여 실시하였다.
- 표준물질로서 사용된 유기산 및 당류는 Sigma Chemical사 (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였다.
이론/모형
- Francis(25)의 알칼리 가수분해법에 따라 색소액을 시험 관에 넣고 질소가스를 충진한 다음 2 N NaOH 1 mL를넣고 다시 질소가스를 충진한 후 밀봉하여 실온에서 2시간 방치하였다. 여기에 2 N HC1 1 mL를 가한 후 ethyl ether로 acyl compounds를 추출한 다음 회 전 감압농축기로 완전 농축시 킨 후 methanol에 용해시 켜 표준물질 인 chlorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid, o~coumaric acid, p-coumaric acid 등을 이용하여 Table 1 에 나타낸 조건에 따라 HPLC를 사용하여 acyl group을 확인하였다.
- 이렇게 얻어진 색소 추출액 중에는 여전히 anthocyanin 이외에 다른 불순물이 섞여 있으므로 anthocyanin-^ 정제와 농축을 위해 양이 온교환수지 관을 통과시 켜 유기 산, 유리 당류 등을 제거하였다. 수지관은 Moms 등(23)의 방법에 의해 Amberlite IRC-50을 관에 충진하고 사용전에 5% HC1 용액을 주입하여 H*형으로 활성화시켜서 사용하였다. 색소농죽액을 이온교환수지관에 주입시켜 수지에 색소를 흡착시킨 후 유출물이 무색이 될 때까지 증류수를 통과시킨 후 0.
- 하였다. 이 분해 액을 ice-water bath에서 냉각한 후 Albach 등(27)의 방법에 따라 isoamyl alcohol로 aglycone 을 제거하였고 ethyl ethers 불순물을 제거하였다. 이 액을 중화시킨 후 기지당인 glucose, xylose, fructose 등을 이용하여 BPW(n~buthanol: pyridin : water, 6 : 3 : 1, v/v/v)를 전개용매로 하여 paper chromatography# 행하였고 Table 1의 조건으로 HPLC system을 이용하여 결합당을 확인하였다.
- 자색 고구마 anthocyanin 색 소의 aglyconee Luh 등의 알칼리 분해법 (24)에 따라서 분석하였다. 시험 관에 농축된 색소액과 2 m止의 2 N HC1 을 넣고 reflux 장치로 100℃ 에서 1시간 가열한 후 isoamyl alcohol로 aglycone 부분을 1 m止씩 3회 추출하였다.
- 자색고구마로부터 anthocyanin 색소의 추출 및 정제는 Morris 등(23)의 방법에 따라 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 자색고구마 100 g을 2 mm 크기로 세절한 후 1% HCl 함유 methanol을 시료가 완전히 잠기도록 가하여 4℃의 암소에서 24시간 방치하면서 색소를 추출하였다. 추출이 끝난 후 색소추출액을 분리하기 위하여 Whatman No.
성능/효과
- 2에 나타낸 것과 같이 각각의 band는 단일의 화합물로 이루어졌음을 알 수 있었다. HPLC를 통하여 얻어진 band 1, 2, 3의 순도는 단일 peak area로 계산하여 각각 99.5, 99.2, 99.3%를 나타내 자색 고구마 anthocyanin색소가 순수분리 되었음을 확인할 수 있었다. 각 개별색소의 용출시간대는 band 1이 4.
- 25분)도 표준물질인 caffeic acid의 용출시간(827 분)과 동일 용출시간을 나타내어 band 3의 acyl compound 는 caffeic acid로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 본 실험 결과 자색고구마 anthocynin 색소의 acyl compound는 ferulic acid와 caffeic acid로 구성되어 있음을 알 수 있는데, Odake 등(16)과 Tsukui 등(17)도 자색고구마 antho-cyanin 색소가 ferulic acid와 caffeic acid로 acylation되어 있음을 보고한 결과와 일치하였다. Band 1은 표준물질과 용출시간이 일치하지 않아 더 이상의 분석을 진행하지 않았다.
- 본 실험 결과로 미루어 보아 자색고구마 anthocyanine 원색소, 3-mono-5-mono glycoside, 5-mono glycoside, 3-diglycoside, 3-mono glycoside, aglycone인 peonidin의 6가지 분해물이 생성됨을 추정할 수 있다, 그리고 자색고구마 anthocyanine aglycone에 3개의 당이 결합된 triose임을 알 수 있다.
- Shin(28)은 elderberry anthocyanin의 aglycone6] 알칼리 분해에 phloroglucinol과 benzoic acid 유도체를 생성 함을 관찰하였는데, pelagonidine hydroxy benzoic acid를 cyanidine protocatechuic acid를 d시phinidine gallic acid를 그리고 peonidine vanillic acid를 생성 한다고 보고하였다. 본 연구 결과에서 는 자색고구마 anthocyanin 색소의 aglycone 이 phloroglucinol과 vanillic acid로 구성되어 있어 자색고구마 anthocynin색소는 peonidin으로 구성 되 었음을 알 수 이었으며, 이는 다른 자색고구마 품종에 대해서 밝혀진 사실과 일치하였다(16, 18, 19, 22).
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 자색고구마 anthocyanin 색소는 peonidin-3-diglucoside-5-monoglucoside°l] caffeic acid 또는 ferulic acid가 acylation된 구조로 구성 되어 있음을 알 수 있다. 현재 이들 anthocyanin 색소의 명 확한 구조의 규명을 위해 MS와 NMR 등을 사용한 자색고구마 anthocyanin 색소의 구조분석이 진행 중에 있다.
- 자색고구마 anthocyanin 색소의 aglycone에 대한 정보를 얻기 위하여 barium hydroxide degradation방법 (28) 과 그 분해산물들에 대해 HPLC system을 이용하여 확인한 결과 Table 2와 같이 band-1, 2, 3에 나타난 자색고구마 anthocyanin 색소의 aglyconee phloroglucinol과 vanillic acid로 구성되어 있었다. Shin(28)은 elderberry anthocyanin의 aglycone6] 알칼리 분해에 phloroglucinol과 benzoic acid 유도체를 생성 함을 관찰하였는데, pelagonidine hydroxy benzoic acid를 cyanidine protocatechuic acid를 d시phinidine gallic acid를 그리고 peonidine vanillic acid를 생성 한다고 보고하였다.
후속연구
- 원래의 자색고구마는 단위 면적당 생산량이 보통의 고구마에 비해 약 60% 정도이고, 색소함량도 높지 않아 경제적 인 가치가 낮은 것으로 알려져 있으나 최근에 농촌진흥청 산하의 호남농업시험장 목포시험장에서 단위 생산량이 높은 건미를 모본으로 하고 일본의 재 래종 자색고구마인 산천자를 부본으로 교배한 육종연구에 의하여 생산량이나 색소함량 면에서 우수한 품종을 개발하여 자미라는 품종명을 부여하였다. 이 신품종의 자색고구마는 anthocyanin의 색소원으로 개발 가능성이 높은 것으로 기대된다(11T5).
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